Özet:

Bu makale, protein saflaştırma stratejilerinde dikkate alınması gereken iki temel faktörü gözden geçirmektedir: aşağı akış uygulama gereksinimleri ve proteinlerin biyolojik özellikleri. Makale, yüksek kaliteli protein saflaştırmanın, özellikle rekombinant proteinlerin üretimi için deneysel verilerin güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği için temel olduğunu vurgulamaktadır. Farklı uygulama senaryoları protein saflığı, aktivite veya endotoksin içeriği için özel gereksinimlere sahiptir ve protein özellikleri saflaştırma stratejilerini önemli ölçüde etkileyebilir. Belirli durumlara göre, makale benzersiz proteinlerin özelleştirilmiş saflaştırma şemalarını benimsemesi gerektiğini göstermektedir. Son olarak, ekspresyon sistemlerinin seçiminden, inşaat tasarımından saflaştırma optimizasyonuna kadar tam işlem kalite kontrolünü vurgulayarak ve biyofiziksel teknikler (Sec-Mals, DSF vb. Bu makale, araştırmacılar için pratik rehberlik sağlamayı, hedef proteinlerin özelliklerine ve uygulama gereksinimlerine dayalı verimli ve tekrarlanabilir saflaştırma stratejileri formüle etmelerine yardımcı olmayı ve böylece bilimsel araştırmaların kalitesini ve verimliliğini artırmayı amaçlamaktadır.

 

Şekil 1. Protein üretim sürecinin şematik diyagramı

 

Yüksek talep edilen protein üretimi - Problem tanımlama örnekleri, azaltma stratejisi tasarımı ve karşılık gelen çıktı

 

1. Nükleik asit proteine ​​bağlanma:

Nükleik asit bağlayıcı proteinleri saflaştırırken, nükleik asit kontaminasyonunu uzaklaştırmak için çoklu adımlar gereklidir. Liziz sırasında nükleazların (SM nükleaz (Benzonase®) veya DNase veya RNase gibi) ilave edilmesi gerekir, ancak bağlı nükleik asitler tamamen çıkarılamaz. PEI veya streptomisin sülfat çökeltme, heparin saflaştırma veya iyon değişim kromatografisi gibi nükleik asit giderme adımlarını değiştirin. Nükleik asitlerin varlığı, saflaştırma işlemi boyunca A26 0 NM\/A28 0 nm oranı ile izlendi. Oran 0.6'dan düşükse, protein saflığının nispeten yüksek olduğunu ve nükleik asit kontaminasyonunun minimum olduğunu gösterdi. Strence bağlı nükleik asitleri olan proteinler için geçici olarak denatüre edilebilir (üre ile muamele edilebilir) ve daha sonra yenilenebilirler. Anahtar Noktalar: Yüksek kaliteli reaktifler, taze tamponlar ve temiz sütunlar kullanın (kullanımdan önce 0.5m NaOH ile temiz).

 

2. Fare ferritin ağır zincir:

Saflaştırılmış fare ferritin ağır zincir (MFTH1) proteini üretmenin amacı, yüksek çözünürlüklü tek partikül kriyo-elektron mikroskopisidir (kriyo-EM). Etiketlenmemiş MFTH1'i kodlayan Escherichia coli ekspresyon vektörü, herhangi bir nükleaz eklenmeden ultrasonik olarak bozuldu. 7 0 derecesinde ısıtıldıktan sonra amonyum sülfat çökeltme, diyaliz ve boyut dışlama kromatografisi adımları geçirildi. Ortaya çıkan örnek, kriyo-elektron mikroskopi görüntülerinde (Şekil 2A) büyük miktarda kirletici maddesinin varlığını gösterdi, bu da uygulaması için tamamen uygun değildi. Adımları optimize edin. Hücre liziz işlemi sırasında Sm nükleaz ekleyin ve amonyum sülfat çökeltmesinden sonra diyaliz işlemi ekleyin ve daha sonra A26 0 nm\/a280nm oranını 1.4 ila 0.8 arasında azaltmak için anyon değişim kromatografisi aşamasını ekleyin. Boyut hariç tutma kromatografisinden sonra, son MFTH1 örneğinin A260NM\/A280NM oranı 0.56 idi. SDS-PAGE ve kriyo-elektron mikroskopi görüntüleri (Şekil 2B), proteinin çok saf olduğunu gösterdi, bu da kirleticilerin etkili bir şekilde çıkarıldığını gösterdi.

Şekil 2 Fare ferritin ağır zincir

 

 

 

3. kimerik protein insan DSRBEC (DSRBD-Egf-Chimera):

DSRBEC, insan protein kinaz R ve insan epidermal büyüme faktörünün (HEGF) çift sarmallı RNA bağlanma alanının (DSRBD) füzyonu ile oluşturulur. DSRBD Escherichia coli'de eksprese edildiğinde, son derece yüksek bir dsRNA bağlanma kabiliyeti gösterir. Hücre lizisinden sonra, kontamined RNA, rekombinant proteinlerin sabit metal iyon afinite kromatografisi (IMAC) kolonuna bağlanmasını engelleyecektir. PEI veya streptomisin sülfat çökelmesi, RNaz tedavisi veya yüksek tuzlu tampon çözeltileri gibi geleneksel yöntemler RNA'yı uzaklaştıramaz. Hücre lizizi, 4M üre içeren bir tampon kullanılarak yapıldı. Süpernatan bir IMAC kolonuna yüklendi ve 4m ila 0 m üre yavaş yavaş gece boyunca kullanıldı (kolon renatürasyonu). Renatürasyon tamponu imidazol ile ilave edildi ve iMac sütunundan elüte edildi. Son arıtma, fonksiyonel olarak aktif DSRBEC elde etmek için Superdex 75 jel filtrasyonu yoluyla gerçekleştirildi.

 

4. Yüce katyonlara veya diğer kofaktörlere bağlı proteinler:

Zn 2+, Fe 2+, cu 2+ veya diğer kofaktörler gibi iki değerlikli katyonlarla etkileşime giren proteinler için, ekspresyon sırasında spesifik iki değerlikli katyon (veya diğer kofaktörler) eklemek çok önemlidir. Saflaştırma işlemi sırasında aynı değersiz katyonların (veya diğer kofaktörlerin) az miktarda gereklidir. Bununla birlikte, herhangi bir şelalama ajanının (EDTA, EGTA gibi) ve kenetleme azaltıcı ajanlarının (DTT veya DTE gibi) kullanılmasından kaçınılmalıdır. Yüce katyonlara bağlı proteinlerle uğraşırken, şelalama ajanları olmayan bir proteaz inhibitörleri karışımı, saflaştırılmış protein içindeki iki değerlikli katyonların (veya diğer kofaktörlerin) gerçek varlığını doğrulamak için kullanılmalıdır (atomik absorpsiyon spektrofotometrisi gibi).

 

5. Termofilik siyanobakteri mastigocladus laminosus'tan tek bir [2FE ± 2S] kümesi içeren rekombinant ferridoksin (RFD)

Ferridoksin, elektron transfer reaksiyonlarına katılan çözünür bir demir-sülfür proteinidir. Bitki tipi ferrorrororoksin, fotosistem I'in bir elektron alıcısı olarak tek bir [2Fe ± 2S] kümesi taşır. Escherichia coli BL21 (DE3) suşu, 10mm fecl3 ve antibiyotikler içeren TB ortamında rekombinant RFD proteini eksprese etti. IMAC yakalama kolonunun elüsyonu, imidazolü önlemek ve [2FE ± 2S] kümesinin yok edilmesini önlemek için 10 mm histidin içeren bir tampon kullanılarak gerçekleştirildi. Anyon değişimi ve boyut dışlama kromatografisi, kristalizasyon taraması için 12 mg\/ml'ye daha fazla saflaştırma ve konsantrasyon için kullanıldı. Ferrorroroxinin rekombinant üretimi ile karşılaştırıldığında, mavi-yeşil alg mastigokladus laminosus'tan saflaştırılan doğal ferrorroroksin, kristalizasyon sırasında daha yüksek çözünürlük elde etti.

 

6. Antijen olarak kullanılan proteinler

Proteinler genellikle hedefe özgü ligandları geri kazanmak için antijen olarak kullanılır. Dikkate alınması gereken ilk şey, proteinin geleneksel monoklonal veya poliklonal IgG elde etmek için in vivo bağışıklık için mi yoksa deve IgG veya in vitro seçim süreçlerini içeren programlar için kullanılıp kullanılmadığıdır.

 

6.1 Rutin antikor üretimi için kullanılan antijenler

Antijenler monoklonal IgG antikorları üretmek için kullanıldığında, antijenin doğru katlanması genellikle gerekli değildir, çünkü çoğu monoklonal antikor, antijenin yapısından (hatta denatüre antijenlerden (hatta inklüzyon cisim proteinleri gibi) büyük ölçüde etkilenmeyen doğrusal epitopları tanımlar. Bununla birlikte, bağışıklık tepkisine müdahale eden ve hedef olmayan antikorların baskınlığına neden olan güçlü immünojenik kirleticilerden kaçınmak için saflık sıkı bir şekilde kontrol edilmelidir.

 

6.2 Konjugat kütüphanesinin taranması

Deve aşılaması ile elde edilen nanobod kütüphanesinin işlenmesi sırasında antijenin doğal konformasyonunun korunması için özel dikkat gösterilmelidir. Geleneksel antikorlardan farklı olarak, deve antikorları (özellikle nanobodlar), benzersiz dışbükey tamamlayıcı bölge yapılarıyla ilişkili yapısal epitopları tanıma eğilimindedir. Benzer şekilde, in vitro büyük sentetik veya doğal antikor kütüphanelerini tararken, antijen hedef uygulamayla tamamen tutarlı bir yapıyı korumalıdır. Tarama işleminin kendisi önyargısız olduğundan, antijenin yanlış katlanması, toplama veya konformasyonel heterojenliği varsa, doğal olmayan epitopları hedefleyen çok sayıda konjugat taranabilir.

 

 

 

7. Moleküller arası veya moleküller arası disülfür bağları veya serbest sistein içeren proteinler

Disülfür bağları, proteinlerin doğal yapısını stabilize etmek için çok önemlidir. Saflaştırma işlemi sırasında, moleküller arası veya moleküller arası disülfür bağları içeren proteinleri arındırırken, proteinlerin konformasyonel değişikliklerini önlemek için azaltma ajanlarının eklenmesini önlemek ve böylece işlevlerini değiştirmek gerekir. Serbest sistein içeren proteinler için, yapay disülfür bağlarının oluşumunu önlemek için, özellikle depolama sırasında saflaştırma işleminin tüm adımlarında vazgeçilmezdir. En sık kullanılan indirgeyici ajanlar ditiothreitol (DTT), -kaptoetanol (-me) ve Tris (2- karboksietil) fosfin hidroklorür (TCEP) 'dir. DTT veya TCEP ile uyumsuz IMAC reçineleri için, -me kullanılması ve sonraki adımlarda diğer indirgeyen maddelerle değiştirilmesi önerilir.

 

8. Rekombinant antikor fragmanı

Rekombinant antikor fragmanlarının (nanobodlar gibi) yapısı IgG'den daha basit olsa da, işlevleri disülfür bağlarının doğru oluşumuna bağlıdır. Bakteriyel ekspresyon sistemlerinde, optimizasyon stratejilerinin benimsenmesiyle bile, hem çözünür kısımda hem de dahil etme gövdesinde bulunan yanlış katlanmış veya kısmen katlanmış ürünler meydana gelebilir. Daha gizli olarak, doğru katlanmış antikor fragmanlarının bile yüzeydeki hidrofobik plaklar yoluyla çözünür agregatlar (kolloid agregasyonu) oluşturabileceğidir. Bu tür agregaların rutin fonksiyonel testlerde (ELISA gibi) tanımlanması zordur, çünkü çok değerlikli bağlanma monomer afinitesindeki düşüşü maskeleyebilir, ancak varlıkları küçük molekül boyutuna (süper çözünürlük mikroskopisi gibi) dayanan uygulamaları ciddi şekilde etkileyebilir. Bu nedenle, sadece SDS-PAGE'ye güvenmek, örnek kalitesini değerlendirmek için yetersizdir. Monomerleri (ana pikler) agregatlardan (dışlama hacmi pikleri) ayırt etmek için jel filtrasyonu (Şekil 3) gibi biyofiziksel yöntemler benimsenmelidir. Anahtar kontrol noktaları şunları içerir: disülfür bağ oluşumunu teşvik etmek için ifade sırasında redoks ortamının optimize edilmesi ve agregasyonu önlemek için saflaştırıldıktan sonra depolama koşullarının optimize edilmesi. Bu önlemler, antikor fragmanlarının monodispersitesini ve işlevini sağlamak için çok önemlidir.

Şekil 3. Nanobodların çözünür agregatlarının jel filtrasyon ayrımı

 

9. lenfosit reseptörü LLT1'in çözünür fragmanları

Disülfür bağına bağlı proteinlerin rekombinant ekspresyonu (lenfosit reseptörü LLT1 gibi) genellikle katlanma zorluklarıyla karşı karşıyadır. Yabani tip LLT1'in jel filtrasyonu, agregasyon pikleri ve dimer pikleri gösterdi (Şekil 4A), ancak kütle spektrometrisinde dimerdeki eşleştirilmemiş sisteinin neden olduğu yanlış katlanmayı ortaya çıkardı (Şekil 4B). Bu amaçla iki mutant tasarlandı: biri problem sisteini çıkardı, bu da verimde ani bir düşüşe neden oldu (Şekil 4A); Uygun disülfür bağını yeniden yapılandırmak için neosistein sokulmasından sonra, mutant sadece yüksek verim ve iyi bir stabiliteye sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda kristalleşebilir (Şekil 4C) ve 3D yapı, mutantın doğru disülfür bağını oluşturduğunu ve doğal katlamayı koruduğunu doğruladı. Bu durum, jel filtrasyonu ve kütle spektrometresi analizi ile birleştirildiğinde, rasyonel olarak konformal disülfür bağları tasarlayarak, rekombinant proteinlerin katlanma probleminin etkili bir şekilde çözülebileceğini ve stabil yapıları ve yüksek verimlere sahip fonksiyonel proteinlerin elde edilebileceğini göstermektedir.

Şekil 4. Disülfür bağı rekonstrüksiyonu, çözünür LLT1'in katlanmasını ve verimini geliştirir

 

 

 

10. Kolay toplanabilir proteinler

Rekombinant proteinlerin saflaştırılması genellikle toplama problemiyle karşı karşıya kalır ve oluşumu "çekirdeklenme büyümesi" mekanizmasını takip eder-önce az miktarda çözünür agrega oluşur ve daha sonra büyük ölçekli çözünmez bir toplama tetikler. Bu zorluğu ele almak için, çok seviyeli stratejilerin benimsenmesi gerekir: ifade aşamasında bu, suşu optimize ederek, kültür sıcaklığını azaltarak, modifiye edilmiş kültür ortamını veya farklı çözünürleştirici füzyon proteinlerini (böcek\/memeli hücreleri) vb. Saflaştırma aşaması (4 derecelik bir ortamda), hızlı bir şekilde itibaren (4 derecelik bir ortamda) gereklidir (4 derecelik bir ortamda) gereklidir (4 derecelik bir ortamda), ekstrif protein (4 derecelik bir ortamda) gereklidir (4 derecelik bir ortamda), eksprese protein (4 derecelik bir ortamda) gereklidir, bu Sec) agrega çekirdeklerini derhal çıkarmak için benimsenmelidir. Genel olarak konuşursak, tarama tampon çözeltileri, bileşen kompozisyonu, pH değeri, ayrışma maddesi veya çözündürücü gibi faktörler dikkate alınmalıdır (Şekil 5). Ortogonal tespitin (SEC, CD, LS, DSF ve floresan ısısına dayalı sıcaklık kayması gibi) ince optimizasyonu yoluyla, protein kalitesi ve en uygun tampon çözeltisi belirlendi.

Şekil 5. Protein agregasyonunu hafifletmek için stratejiler

 

11. İnsan CLK1 kinazın kristalleşmesi (tekrarlanabilir gruplar nasıl elde edilir)

Kristalleştirme çalışmaları için homojen fosforile olmayan CLK1 kinaz elde etmek için çok strateji bir işbirlikçi şema benimsenmiştir. İlk olarak, otofosforilasyonun heterojenliğini ortadan kaldırmak için Escherichia coli'de λ -fosfataz ile birlikte ifade edildi. Verim azalmasına rağmen, tam fosforilasyon sağlandı. IMAC tarafından yakalandıktan sonra, eluent agregasyonu önlemek için stabilizatörler (50mm arginin, 50mm glutamik asit ve 10mm DTT) ile desteklendi ve etiketi TEV sindirimi ile çıkarıldı. Daha sonra, doğru oligomer SEC ile ayrıldı (% 5 gliserol ve -me içeren). Son önemli anyon değişim aşaması, kristalin (fosforile olmayan) ve kristal olmayan (kısmen fosforile) CLK1 grupları arasında ayrım yapar. Hücre liziz modunun protein stabilitesini önemli ölçüde etkilediğini belirtmek gerekir-yüksek basınç ve yüksek sıcaklık yöntemi, kinaz preparasyonu için hafif tedavinin önemini vurgulayarak CLK1'in geri dönüşü olmayan birleştirilmesine yol açar.

 

 

 

12. Kararlı ligand bağlama kabiliyeti ile galektin -1 üretin

Ligand bağlanma çalışmaları için fonksiyonel galektin -1 hazırlamak için, dört yapının (etiketlenmemiş ve etiketlenmemiş vahşi tip galektin {-1, etiketlenmemiş ve his-etiketli sistein içermeyen mutant galektin -1) karşılaştırıldı. Temel bulgular, laktoz afinite kromatografisi saflaştırmanın doğru katlanmış proteinleri etkili bir şekilde tarayabileceğini, ancak laktozu bağlama bölgesinden tamamen uzaklaştırmak ve CRD aktivitesini geri kazanmak için kapsamlı diyaliz (HEPES tamponu) ile birleştirilmesi gerektiğini göstermektedir. Yabani tip galektin -1 oksidasyon ve inaktivasyona eğilimlidir ve stabilitesi, azaltma ajanlarının varlığında bile sınırlı kalır (Şekil 6). Bununla birlikte, sistein içermeyen mutant, disülfür bağ bağımlılığını ortadan kaldırarak karşılaştırılabilir aglütinasyon aktivitesi ve termal stabiliteyi (nanodsf, ITC vb. Tarafından doğrulanmıştır) korurken uzun süreli stabiliteyi önemli ölçüde arttırır.

Şekil 6. Rekombinant galektinin hidrodinamik karakterizasyonu -1

 

13. Endotoksin giderimi

Endotoksin çıkarma yöntemi, pozitif yüklü kromatografi (anyon değişimi), polikasyonik ligandların (poli-l-lizin (PLL), hareketsiz poliamin (polimiksin B)) ve sürfaktan triton x} -114 gibi afinite kromatografisine dayanmaktadır. Saflaştırma işlemi sırasında, tampon çözeltisinin LPS içermeyen su ile hazırlanmasına dikkat edin ve yalnızca diğer LPS içermeyen saflaştırmalarda kullanılan yeni sütunlar veya sütunlar kullanın. Endotoksin kontaminasyonu için, kromatografik pompa\/sıvı sistemi gece boyunca 0. 5m NaOH içinde veya 1'de 4 saat süreyle inkübe edilebilir. Numunedeki son LPS miktarı, Limulus amebosit lizat reaktifi (LAL) kullanılarak değerlendirildi ve spesifik uygulama için gereken sınırın altında olup olmadığı doğrulandı.

 

14. Protein kompleksi

Protein komplekslerinin ekspresyonu ve saflaştırılması, spesifik koşullara göre optimize edilmelidir. Zorluklar arasında alt birimlerin istikrarsızlığı veya yanlış katlanması yer alır. Her alt birim bağımsız olarak ifade edilebilir ve in vitro olarak monte edilebilir veya fonksiyonel protein kompleksleri oluşturmak için birlikte eksprese edilebilir. İnşaat tasarımı, özellikle karmaşık bilgiler sınırlı olduğunda ve çoklu optimizasyonlar gerektiğinde montaja müdahale etmekten kaçınmak için saflaştırma veya algılama etiketleri ile dikkatle sokulmalıdır. Saflaştırma işlemi sırasında, kompleksin bütünlüğü ve stabilitesi değerlendirilmelidir. Yöntemler arasında SDS-PAGE (alt birim tespit), SEC (homojenlik), SEC-Mals (molar kütle analizi), kütle fotometrisi veya doğal kütle spektrometrisi (kütle doğrulaması) bulunur. Kompleksin düşük konsantrasyonlarda ayrışabileceğine dikkat edilmelidir. Şu anda, kromatografik yöntem veya tampon (termal sürüklenme veya DSF tarama koşulları gibi) optimize edilmelidir. Ayrıca, saflaştırma adımlarının azaltılması, zayıf etkileşim alt birimlerinin kaybını önleyebilir ve kompleksin saflaştırma verimliliğini ve bütünlüğünü dengeleyebilir.

 

 

 

15. Antijen-antikor komplekslerinin saflaştırılması

Antikor-antijen kompleksleri, protein komplekslerinin tipik örnekleridir. Ko-kristalizasyonu bağlanma modellerini ortaya çıkarabilir ve antikor mühendisliğinin optimizasyonunu yönlendirebilir. Geleneksel yöntemler, antijenlerin ve antikorların ayrı saflaştırılmasını ve daha sonra bunları karıştırmayı gerektirir. Bununla birlikte, son çalışmalar birlikte ekspresyon ve birlikte saflaştırma stratejilerinin daha verimli olduğunu göstermiştir. Kompleksi elde etmek için sadece tek bir saflaştırma gereklidir ve aynı zamanda, antikorlar yoluyla dengesiz antijenler stabilize edilebilir ve hatta etiketsiz ekspresyon elde edilebilir. Bu özel durumda, kompleksin saflığını ve kalitesini değerlendirmek için genellikle SDS-PAGE ve jel filtrasyonu (SEC) yeterlidir.

 

Özet

Protein saflaştırması bilimsel araştırmalarda temel bir teknolojidir. Akademik ölçekli protein üretimi genellikle standart stratejileri takip eder ve yapısal biyoloji, biyokimya ve fonksiyonel araştırmalarda yaygın olarak kullanılan miligram düzeyinde yüksek saflıkta, çözünür proteinler üretebilir. Bununla birlikte, aşağı akış uygulamalarının özel gereksinimleri (hayvan deneylerinde endotoksin ihtiyacı ve nükleik asit araştırmalarında nükleaz kontaminasyonu yok) veya proteinlerin (kolay agregasyon, disülfür bağları veya yüksek nükleik asit afinitesi içeren) doğal özellikleri genellikle özelleştirilmiş çözümler gerektirir. Bu inceleme, bu özel koşullara yanıt olarak, ifade sistemlerinin seçimi, yapıların tasarımı (etiketleri ve alan sınırlarını optimize etme) saflaştırma sürecine kadar değişen rafine stratejiler önermekte ve anahtar adımlarda kalite kontrolünü (SEC, SDS-PAGE, aktivite algılama vb.) Tanıtmaktadır. Bazı uygulamalar ayrıca biyofarmasötik endüstrisindeki "kalite güvencesi" (KG) kavramına benzer şekilde ek analizler (endotoksin saptama ve nükleik asit kalıntısı tayini gibi), yani sistematik süreçler yoluyla kusurları önlemek için gerektirir. Bilimsel araştırmalarda kullanılan protein reaktifleri için kalite kontrol kılavuzları ve belirli standartları netleştirerek, amaç akademik laboratuvarlar için daha titiz protein saflaştırma normları oluşturmak, deneysel verilerin güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini arttırmak ve temel araştırma ve endüstriyel standartlar arasındaki boşluğu kapatmaktır.

 

Doi: 10.1186\/s 12934-022-01778-5