Virüs benzeri parçacık aşısı ve aşağı akım saflaştırma işlemi

Virüs benzeri parçacık (VLP) aşısı, virüs yapısına dayanan ancak viral genetik malzemeleri içermeyen bir aşı teknolojisidir. Doğal virüslerin morfolojisini ve yüzey antijenlerini taklit ederek güçlü bir bağışıklık tepkisini uyarırlar ve çoğaltılamamaları nedeniyle daha fazla güvenlik sağlarlar. VLP aşıları geleneksel aşılara daha iyi bir alternatiftir (canlı zayıflatılmış ve inaktive edilmiş). VLP aşısı vücutta çoğaltılamaz, bu nedenle hamile kadınlar veya bağışıklık sistemleri olanlar da dahil olmak üzere herkes için uygundur. Ek olarak, influenza virüsleri, Afrika at hastalığı virüsleri ve bluetongue virüsleri gibi segmentli genomlara sahip virüslerden kapsid proteinleri (diğer yapısal proteinler dahil), zayıflatılmış canlı aşılar gibi genetik rekombinasyon sorunları hakkında endişelenmeden VLP aşıları geliştirmek için de kullanılabilir. İkincisi, VLP'ler, yapısal proteinleri inaktivasyon sırasında modifiye edilebilen, immünojenik bozuklukla sonuçlanan inaktive edilmiş aşıların aksine, gerçek virüslerin yapısını taklit edebilir.

 

İNCİR. 1. VLP'lerin ve kimerik VLP'lerin oluşum mekanizması

 

VLP aşısının özellikleri

1. Doğal virüslere benzer yapı: VLP'ler, viral bir veya daha fazla yapısal protein (kapsid proteinleri gibi) tarafından kendi kendine monte edilir ve boyutları ve şekilleri gerçek virüslere benzer.

2. Enfeksiyöz: Viral genomu içermez, hastalığı kopyalayamaz veya neden olamaz.

3. Yüksek immünojenisite: Granüler yapı, bağışıklık sistemi tarafından verimli bir şekilde tanınabilir ve B hücresi ve T hücresi tepkilerini aktive edebilir. Nötralize edici antikorları ve hücresel bağışıklığı indükleyebilir (örn., HIV, HPV aşıları).

4. Yüksek güvenlik: Düşük bağışıklık fonksiyonu olan kişiler için uygundur (hepatit B VLP aşısı gibi).

 

İNCİR. 2. Mevcut VLP aşıları

 

VLP aşı üretim sistemi

VLP'ler çeşitli ifade sistemleri aracılığıyla üretilebilir, ortak platformlar şunları içerir:

 

1. Böcek hücre-bakulovirüs sistemi:

Avantajları: Yüksek verim, düşük maliyet, karmaşık protein düzeneği için uygun.

Uygulama: HPV aşısı, Ebola aşısı.

 

2. Memeli hücreleri (örneğin HEK293 hücreleri):

Avantajlar: Translasyon sonrası modifikasyonlar insanlara daha yakındır ve zarflı VLP'ler (grip aşıları gibi) için uygundur.

 

3. Maya Sistemleri (örneğin Pichia Pastoris):

Avantajları: Hepatit B aşısında hızlı, düşük maliyetli kullanılmıştır.

 

4. Bitki sistemleri (örneğin tütün kloroplastları):

Çevre dostu ve ölçeklenebilir, geliştirilmede (örn. Norovirüs VLP aşısı).

 

VLP aşısının akış aşağı saflaştırma işlemi

VLPS ekspresyon sistemlerinin çeşitliliği, akış aşağı saflaştırma süreçlerinin bağımsızlığına yol açar.

 

 

İNCİR. 3 Genel bir alt işlem akış şeması

 

Hasat ve açıklama:

Hücre kültürü tarafından desteklenen her tür kültür ortamında, çok sayıda virüs parçacığının yanı sıra birçok hücre dokusu döküntüsü, metabolik ürünler ve diğer safsızlıklar vardır, kültür ortamını doğrudan konsantre ederse, ultrafiltrasyon membranını konsantre ederse, konsantrasyonun tamamlanamayacağı ve ultraviltrasyon membrasyonu scrap. Bu nedenle, ilk olarak konsantrasyondan önce, kültür ortamındaki büyük parçacıkları uzaklaştırmak için netleştirilmelidir, böylece yarı saydam veya şeffaf bir çözelti haline gelir ve kültür ortamının konsantrasyonu konsantrasyon işlemini normal hale getirebilir ve ultrafiltrasyon membranının hizmet ömrünü sağlayabilir. Kültür çözeltisinin konsantrasyonundan önce açıklama, konsantrasyon sürecinde önemli bir teknik bağlantıdır.

 

Etkin bir açıklama işlemi, katı parçacıkları gidermek için yüksek kapasitenin bir kombinasyonunu, yüksek ürün verimini, kolay ölçeklendirme ve akış aşağı işletim birimlerine koruma gerektirir.

 

Yöntem

Santrifüj: Diferansiyel santrifüjleme büyük partikülleri giderir.

Derin Filtrasyon: Süpernatanı netleştirmek için çok aşamalı bir filtre (örn. 1.2μm → 0. 45μm) kullanın.

Teğetsel akış filtrasyonu (TFF): Kütle üretimi için uygundur, örnekleri konsantre eder ve küçük safsızlık parçacıklarını giderir.

 

Bununla birlikte, yetiştirme ölçeği çok büyükse, santrifüj uzun zaman alır, çok sayıda derin filtre membran gerekecektir, bu nedenle sarf malzemelerinin maliyeti büyük ölçüde artar. Aynı zamanda, hücre kültürünün yüksek yoğunluğu, derin filtre membranının yükünü azaltır, bu da maliyetlerin artmasına ve aşırı ürün seyreltmesine neden olur.

 

İki tür TFF membran bileşeni vardır: düz kaset ve içi boş fiber. Teğetsel akış filtrasyonu (TFF), transmembran basınç farkı tarafından yönlendirilir. Membran gözenekinden daha küçük maddeler ve safsızlıklar membrandan geçerken, daha büyük parçacıklara sahip hücreler gibi safsızlıklar sıkışır. Mikrofiltrasyon için kullanılan zarın gözenek boyutu {{0}}. 45/0.22μm'dir. İçi boş elyaf, yüksek yoğunluklu hücre kültürü ortamı gibi yüksek katı içerik sıvısını doğrudan işleyebilir, santrifüjleme ve ön filtrasyon adımlarını, daha az adım, basit çalışma, membran temizleme yoluyla tekrar tekrar kullanılabilir, ekipman yatırımlarını ve işletim maliyetlerini modüler otomatik üretim gereksinimleri doğrultusunda azaltabilir.

 

Ultrafiltrasyon konsantrasyonu (TFF):

Hedef: Kromatografik tedavi miktarını azaltmak için kromatografik verimliliği iyileştirin ve kromatografik kolonunu koruyun.

Genel olarak, ultrafiltrasyon (TFF) 100 kattan fazla VLP konsantre olabilir ve heteroproteinin çıkarma oranı%99'a ulaşabilir. Bunlar arasında, içi boş fiber membran filtrasyon teknolojisi, hafif ve düşük kesme kuvvetinin avantajlarına sahiptir, takılması kolay değildir, esnek çalışma, uzun ömür, düşük maliyet ve kolay amplifikasyon, bu nedenle konsantre ve saflaştırılmış VLP için içi boş fiber seçilmesi önerilir.

 

Konsantrasyon ve saflaştırma için ultrafiltrasyon yöntemi kullanıldığında, konsantrasyonun verimliliğini ve kalitesini doğrudan belirleyen doğru membran gözenek boyutunu seçmek çok önemlidir. Bir yandan, verimi sağlamak için hedef molekülleri etkili bir şekilde tuzağa düşürmek için membran diyaframının seçilmesi gerekir, diğer yandan heteroproteinlerin çıkarma etkisi ve işleme hızı tamamen dikkate alınmalıdır. Bu nedenle, en iyi prensip, hedef molekülü yakalayabilen en büyük gözenek boyutuna sahip zarın seçilmesi ve düzgün gözenek boyutu dağılımına sahip filtre membranını seçmeye çalışmaktır.

 

Birincil saflaştırma:

1. Yağış yöntemi

Polietilen glikol (PEG) yağış: VLP'lerin seçici çökelmesi, verimi ve saflığı dengelemek için optimize edilmiş PEG konsantrasyonu ve tuz konsantrasyonu gerektirir.

 

2. Kromatografi

Afinite kromatografisi:

Heparin afinitesi: Yüzey negatif yükünün VLPS özelliklerini kullanma (örn., HPV VLP).

Antikor bağlantısı kromatografisi: yüksek özgüllük ama pahalı.

İyon Değişim Kromatografisi (IEX): VLP yüzey yükü özelliklerine bağlı olarak anyon değişimi (örn. Q kolonu) veya katyon değişimini (örn. SP sütunu) seçin ve partikül agregasyonunu önlemek için pH ve tuz gradyanını optimize edin.

Hidrofobik etkileşim kromatografisi (HIC): VLPS yüzeyi hidrofobikliğine dayanarak, kapsüllenmemiş bazı VLP'ler için uygundur.

 

İnce saflaştırma:

Moleküler dışlama kromatografisi (SEC, jel filtrasyonu):

Tampon replasmanı eşliğinde artık konakçı proteinlerin, nükleik asitlerin veya agregatların uzaklaştırılması. Yüksek çözünürlükte ancak düşük akı, genellikle son arıtma adımı olarak kullanılır.

 

Çok modlu kromatografi:

Örneğin, Capto Core serisi reçineler, iyon değişimi ve moleküler elek etkisi ile birleştirildiğinde, çeşitli safsızlıkları bir adımda kaldırabilir.

 

Virüs inaktivasyonu/nükleik asit çıkarma (gerekirse):

Nükleaz tedavileri: Benzonaz konakçı DNA/RNA'yı bozar.

UF/DF: Küçük nükleik asit ve enzim parçalarını uzaklaştırmak için TFF sisteminin koordine edilmesi.

 

Konsantrasyon ve Hazırlık:

Teğetsel akış filtrasyonu (TFF):

Tamponları (PBS veya formülasyon tamponları gibi) değiştirirken hedef titrelere konsantre olun.

 

Steril filtrasyon:

0. 22μm membran filtrasyonu sterilite sağlar.

 

Tipik durum

Tipik VLP aşıları için aşağı akım saflaştırma işlemleri aşağıdadır.

 

 

Yönlendirme hakkında

Rehberlik teknolojisi, biyofarmasötiklerin aşağı yönlü açıklamasına, ayrılmasına ve saflaştırılmasına odaklanan üretim odaklı ve yüksek teknolojili bir girişimdir. Ürünler mAb, aşı, tanı, kan ürünleri, serum, endotoksin ve diğer biyolojik ürünlerin filtrasyon işleminde yaygın olarak kullanılmaktadır; Kılavuz teknolojisi, "kaset filtresi ve teğet akış filtrasyon cihazı", "içi boş fiber membran", "virüs filtresi", "derin membran", "sterilizasyon filtresi", "santrifüj filtre cihazları" ve diğer ürünlere sahiptir ve küçük tek kullanımlık filtrelemeden üretim ve testin ihtiyaçlarını karşılamaktadır. Rehberlik teknolojisi sizinle işbirliği yapmayı dört gözle bekliyor!