Sığır Enfeksiyöz Rinotrakeit (IBR) Aşısı İçin Endüstriyel-Ölçekli Aşağı Yönde Saflaştırma Prosesi — "Ultrafiltrasyon" Bölümü

Sığır enfeksiyöz rinotracheitis (IBR), sığır herpesvirüsü tip 1 (BHV-1) olarak da bilinen sığır enfeksiyöz rinotracheitis virüsü (IBRV) enfeksiyonundan kaynaklanır. Hastalık esas olarak solunum semptomları ve düşük ile karakterizedir. Bu klinik belirtilere ek olarak IBR, süt sığırlarında süt veriminin azalmasına ve besi sığırlarında kilo alımının azalmasına neden olabilir ve bu da hayvancılık çiftlikleri için önemli ekonomik kayıplara neden olabilir.

Hastalık doğası gereği immünsüpresiftir. Tek bir enfeksiyon olarak ortaya çıktığında patojenitesi nispeten düşüktür; ancak diğer viral veya bakteriyel hastalıklarla karışık enfeksiyonlar ortaya çıktığında şiddeti ve zararı önemli ölçüde artar. Aşılama, önleme ve kontrol için en etkili yöntemdir ve iki ana aşı türü mevcuttur: canlı zayıflatılmış aşılar ve inaktif aşılar. Şu anda çiftliklerde kullanılan sığır bulaşıcı rinotrakeit aşıları ağırlıklı olarak inaktif aşılardır.

Canlı zayıflatılmış aşılar, güçlü immünojenite, hızlı bağışıklık başlangıcı ve uzun süreli koruma (genellikle altı aydan fazla) ile karakterize edilir. Hastalık salgınları sırasında acil aşılama için yaygın olarak kullanılırlar. Ancak virüs bulaşması açısından potansiyel risk taşırlar, hamile inekler için risk oluştururlar ve latent enfekte ancak asemptomatik sığırlarda kullanılamazlar.

İnaktive aşılar, virüs yayılımı veya virülansa dönüş riski olmayan, yüksek güvenlik ile karakterize edilir ve kesinlikle güvenli kabul edilir. Hamile inekler, buzağılar ve damızlık boğalar dahil olmak üzere tüm aşamalardaki sığırlarda kullanılabilirler. Bununla birlikte, bağışıklığın başlaması nispeten yavaştır ve koruma süresi daha kısadır, bu nedenle genellikle takviye aşılarına ihtiyaç duyulur. Bazı durumlarda koruyucu etkinliği canlı zayıflatılmış aşılardan daha zayıf olabilir.

Canlı zayıflatılmış aşı veya etkisizleştirilmiş aşı kullanılmasına bakılmaksızın, aşağı yöndeki saflaştırma işlemi dört ana aşamaya ayrılabilir: hasat ve berraklaştırma → konsantrasyon ve birincil saflaştırma → parlatma saflaştırması → etkisizleştirme/steril filtreleme ve formülasyon.

Konsantrasyon, aşıların arıtılma işleminin hemen ardından gelen alt saflaştırma sürecinde temel bir adımdır. Birincil hedefi, viral biyoaktiviteyi korurken, hasat edilen büyük-hacimli, düşük-konsantrasyonlu virüs arıtılmış solüsyonunu hızla küçük-hacimli, yüksek{-konsantrasyonlu bir forma dönüştürmektir. Bu, kromatografi gibi sonraki yüksek-çözünürlüklü ancak düşük- kapasiteli hassas saflaştırma adımları için gerekli koşulları yaratır.

Bu adım tipik olarak teğet akışlı ultrafiltrasyon (TFF) kullanılarak gerçekleştirilir. Prensip şu şekildedir: viral besleme çözeltisi, belirli bir gözenek boyutuna sahip bir ultrafiltrasyon membranının yüzeyine paralel olarak akar. Basınç altında, su, tuzlar ve bazı safsızlıklar gibi küçük moleküller membrandan dik olarak geçerek uzaklaştırılırken, membran gözeneklerinden çok daha büyük olan bozulmamış virüs parçacıkları tutulur, sürekli olarak yeniden sirküle edilir ve konsantre edilir. Geleneksel yüksek-hızlı santrifüjlemeyle karşılaştırıldığında bu yöntem, lipit zarfı olan IBRV gibi hassas virüslere karşı daha hassastır. Yüksek kesme kuvvetlerinin neden olduğu virüs yapısal hasarını ve aktivite kaybını etkili bir şekilde azaltır ve endüstriyel üretim için-doğrusal ölçeklendirmeye daha uygundur.

Başarılı bir konsantrasyon işlemi sadece hacmi azaltmaktan çok daha fazlasıdır. Proses optimizasyonuna yönelik kilit noktalar şunları içerir: konsantrasyon polarizasyonunu ve membran kirlenmesini en aza indirirken filtrasyon verimliliğini dengelemek için membran ötesi basıncı ve besleme akış hızını hassas bir şekilde kontrol etmek; yüksek virüs tutma ve nüfuz akışını sağlamak için uygun membran malzemesinin ve gözenek boyutunun seçilmesi; ve virüs geri kazanımı, konsantrasyon faktörü ve işlem süresi arasında en uygun dengeyi bulmak. Konsantre viral süspansiyon yalnızca önemli ölçüde daha yüksek bir titre elde etmekle kalmaz, aynı zamanda suda çözünebilen yabancı maddelerin büyük bir kısmını gidererek ön saflaştırmayı da sağlar. Bu, kromatografi ve nükleaz tedavisi gibi sonraki kritik arıtma adımları için gerekli hacim ve konsantrasyon temelini sağlar ve konsantrasyonu tüm alt proseste merkezi bir verimlilik merkezi haline getirir.

İkincil diyafiltrasyon, aşı aşağı saflaştırmasında kritik bir adımdır ve hassas saflaştırmadan sonra ve formülasyondan önce konumlandırılır. Tipik olarak kromatografi ve nükleaz işleminin ardından gerçekleştirilir. Temel amacı ilk konsantrasyon değil, sistem değişimi ve son formülasyon koşullarının hassas şekilde ayarlanmasıdır. İşlem, taze, temiz formülasyon tamponunun dolaşımdaki konsantre viral çözeltiye sürekli olarak eklendiği, orijinal çözücünün ve küçük-molekül yabancı maddelerinin uzaklaştırıldığı bir teğet akışlı ultrafiltrasyon (TFF) sisteminde gerçekleştirilir. Bu işlem, artık tuzları, organik çözücüleri, nükleaz bozunma ürünlerini ve saflaştırma işleminden kalan eser miktarda çözünebilir yabancı maddeleri etkili ve hassas bir şekilde ortadan kaldırır.

Önemli olan, virüs konsantrasyonunun formülasyon spesifikasyonlarını karşıladığından emin olmak için sabit hacmi korumak veya küçük konsantrasyon ayarlamaları uygulamaktır. Sığır bulaşıcı rinotracheitis virüsü (IBRV) gibi kırılgan, zarflı virüsler için, ikincil diafiltrasyonun yumuşak hidrodinamik ortamı, partikül bütünlüğünün ve immünojenitenin korunması açısından çok önemlidir. Sonuçta bu adım, sonraki inaktivasyon (gerekiyorsa), adjuvan veya stabilizatör ilavesi ve son dolum için sağlam bir temel sağlayarak nihai ürünün formülasyona tanımlanmış bileşenlerle, tekdüze koşullarla ve iyi uyumlulukla girmesini sağlar. Bu nedenle aşı güvenliğini, stabilitesini ve seriler arası-seriler{-tutarlılığını sağlamak için temel adımlardan biridir.

IBRV, yaklaşık olarak küresel bir zarfa sahip, zarflı, çift-sarmallı doğrusal bir DNA virüsüdür. Olgun IBRV parçacıklarının çapı yaklaşık 160-230 nm'dir. Buna göre, 100, 300 veya 500 kDa ultrafiltrasyon membranlarının kullanılması, bazı kirletici proteinleri uzaklaştırırken IBRV'yi tutabilir. Jiuling Teknolojisi membran kasetlerinin ultrafiltrasyon geri kazanım oranı, besleme malzemesinin türüne göre değişir ancak genellikle %90-95'e ulaşır.