Membran Teknolojisi ve Aşı Berraklaştırması (Ⅰ)
Aşılar; doku özütleri, bakteri hücreleri, viral partiküller, memeli rekombinant hücreleri, maya ve böcek hücreleri tarafından üretilen proteinler ve nükleik asitler dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan gelir.
Aşı üretiminin en yaygın yöntemi, ilk fermantasyon sürecini ve ardından saflaştırmayı temel alır. Aşı üretimi, birçok farklı adım ve süreci içeren karmaşık bir süreçtir. İstenen nihai ürün saflığını elde etmek için doğru saflaştırma yöntemini seçmek kritik öneme sahiptir. Aşıların berraklaştırılması, ürün geri kazanımı ve sonraki akış saflaştırması üzerinde önemli bir etkiye sahip olan önemli bir adımdır. Aşıları berraklaştırmak için çeşitli teknikler kullanılabilir. Toplama yöntemi ve ekipmanının seçimi, pilin türüne, toplanan ürünün doğasına ve işlem sıvısına bağlıdır. Bu teknikler arasında membran filtrasyonu (mikrofiltrasyon, teğetsel akış filtrasyonu), santrifüjleme ve derin filtrasyon (normal akış filtrasyonu) bulunur. Uzun bir deneyime göre, aşı hasadı berraklaştırılması genellikle santrifüjleme ve ardından derin filtrasyonla elde edilir.
Son yıllarda, membran bazlı teknikler aşı berraklaştırmasında öne çıkmıştır. Yukarı akış süreçleri giderek daha fazla tek kullanımlık teknolojiler kullanmaktadır, bu nedenle hasat stratejileri değişmelidir. Bu makale, farklı membran bazlı teknolojilere ve aşı berraklaştırmasındaki uygulamalarına ilişkin kapsamlı bir genel bakış sunmaktadır.
01 Giriş
Aşılar, hala şok edici bir ölüm nedeni olan bulaşıcı hastalıkların önlenmesinde kritik bir bileşendir. Her yıl 2 ila 3 milyon insan, bağışıklama sayesinde difteri, tetanos, boğmaca ve kızamıktan kurtulmaktadır. Aşılar, küçük rekombinant proteinlerden tüm virüs parçacıklarına ve tüm bakterilere kadar geniş bir yelpazeyi kapsar. Farklı sistemler tarafından üretilebilirler: yumurtalar, memeli hücreleri, bakteriler, vb. Aşıların karmaşıklığı ve çeşitliliği nedeniyle, aşı platformlarına olan ilginin artmasına rağmen şu anda ana akım bir saflaştırma protokolü veya şablonu bulunmamaktadır.
Tipik olarak, bir aşı işlemi üç bölüme ayrılabilir: yukarı akış (üretim ve berraklaştırma), aşağı akış işlemi (ultrafiltrasyon, kromatografi ve kimyasal işlem dahil saflaştırma) ve formülasyon (son dolum işlemleri). Üretim sisteminden bağımsız olarak, berraklaştırma (istenmeyen maddelerin başlangıçta uzaklaştırılması), sağlam bir berraklaştırma işleminin belirlenmesinde önemli bir rol oynar. Uygun bir berraklaştırma adımı, aşağı akış işleminin yükünü azaltmak için esas olarak tüm hücreleri, hücre artıklarını, kolloidleri ve büyük agregaları uzaklaştırır. Bazı durumlarda berraklaştırma, çözünmeyen safsızlıkları, konak hücre proteinlerini (HCP) ve konak hücre nükleik asitlerini de azaltabilir. Diğer tüm saflaştırma adımlarında olduğu gibi, berraklaştırma adımının aşının özgüllüğüne ve üretim kısıtlamalarına uyum sağlarken maksimum ürün verimi ve saflığına ulaşmak için optimize edilmesi gerekir.
Aşı tiplerinin heterojen olması nedeniyle, santrifüjleme veya filtrasyon gibi çeşitli arıtma teknikleri kullanılmaktadır (Tablo 1).
İstenilen berraklaştırmayı elde etmek için genellikle birkaç seri işlem gerekir. İlk işlem daha büyük parçacıkları (birincil berraklaştırma) gidermek için tasarlanmıştır ve ikinci işlem kolloidleri ve diğer alt mikron parçacıklarını (ikincil berraklaştırma) gidermek için tasarlanmıştır. Düşük hızlı santrifüjleme, hücrelerin ve hücre artıklarının çökeltme yoluyla giderilmesine olanak tanıyan tek seferlik bir berraklaştırma seçeneği olarak hizmet eder. Santrifüjleme yüksek katı yüklerini kaldırabilir ve toplu veya sürekli modda ve disk santrifüjlerinde yaygın olarak kullanılmıştır. Yüksek sermaye yatırımı ve bakım maliyetleri gerektirir ve güvenilir bir ölçek küçültme modelinin olmaması nedeniyle ölçeklendirmede zorluklarla karşı karşıyadır. Ancak bazı ticari aşı üreticileri, yüksek işleme hacimleri ve daha fazla üretim faaliyeti içeren büyük ölçekli üretimde santrifüjler kullanır.
Berraklaştırma filtrasyonu, normal akış filtrasyonu (NFF, aynı zamanda çıkmaz filtrasyon olarak da bilinir) veya teğetsel akış filtrasyonu (TFF, aynı zamanda çapraz akış filtrasyonu olarak da bilinir) ile gerçekleştirilebilir. Ayrıca, pozitif yüklü malzemeler ve hücre döküntülerinin, kolloidlerin ve negatif yüklü istenmeyen bileşenlerin tutulmasını artıran filtre AIDS'leri içeren belirli filtre modları (derin filtreler) da vardır.
Membran filtreler parçacıkları boyut dışlama yoluyla tutar ve yüksek kir tutma kapasitesine sahip değildir, bu nedenle ikincil arıtma adımları için uygundurlar. Hem derin filtreler hem de membran filtreler ölçeklenmesi ve uygulanması kolaydır (basit sistem tasarımı). NFF'den farklı olarak, TFF esas olarak birincil arıtma (mikrofiltrasyon) için kullanılır. 0.1-0.65 μm'lik bir kesme aralığına sahip membranlar (tercihen açık kanallı) hücreleri, hücre artıklarını ve diğer büyük kirleticileri tutmak için başarıyla kullanılmıştır. Çoğu TFF ekipmanı doğrusal olarak ölçeklenebilir ve temizlendikten sonra yeniden kullanılabilir, bu da adım için sarf malzemelerinin maliyetini önemli ölçüde azaltır.
Berraklaştırma adımı, yukarı ve aşağı akış süreçleri arasında yer alır ve bazen aşı prosesi geliştirme sırasında göz ardı edilir çünkü zaman ve kaynaklar kromatografi veya yoğunluk gradyan santrifüjlemesi gibi diğer saflaştırma adımlarına öncelik verilir.
Aşı üretim süreçleri için patentler bile genellikle berraklaştırma adımını atlar. Berraklaştırma verimliliği, doğrudan alt akış sürecinin performansını etkiler. Kötü optimize edilmiş bir berraklaştırma adımı, sterilize edilmiş filtrenin kapasitesini olumsuz etkileyebilir veya kromatografik reçinenin hizmet ömrünü kısaltabilir. Günümüzde, daha sıkı düzenleyici beklentiler aşı üreticilerinin daha saf, iyi karakterize edilmiş ancak uygun fiyatlı aşılar üretmesini sağlama eğilimindedir. Bu durumda, her adıma hak ettiği ilgi gösterilmelidir. Mevcut eğilimler, üst akış sürecinin daha yüksek üretkenlik ve daha yüksek hücre yoğunluğu ile "daha temiz" bir ifade sistemine (yani serumsuz ortamda kültürlenen hücreler yumurtaların yerini alır) doğru ilerlediğini göstermektedir.
Son ürünün saflığını artırmak için akış aşağısı arıtma süreçleri basitleştiriliyor ve düzene sokuluyor. Bu değişiklikleri idare etmek için, berraklaştırma adımı bir darboğaz haline gelemez. Bu durumda, filtrasyon teknolojisi yeni bir berraklaştırma zorluğuyla karşılaşıyor ve artan süreç esnekliği, tek kullanımlık olma olasılığı ve azaltılmış yatırım maliyetleri sorunlarını ele alıyor.
02 Virüs aşılarının açıklığa kavuşturulması
Aşıların yem ucunda hasadı berraklaştırmak için, tek başına veya kombinasyon halinde çeşitli tipte berraklaştırma yöntemleri başarıyla kullanılmıştır.
Pilot ölçeği:1-20L, üretim ölçeği: 20L'den fazla
2.1 Virüs aşısının açıklanması için önlemler
Birçok aşı, viral enfeksiyona karşı bağışıklık oluşturmak için virüs parçacıklarının tamamını veya bir kısmını içerir. Genellikle dört geniş kategoriye ayrılırlar:
Virüsün virülansını azaltmak için zayıflatılmış bir virüs suşuna dayanan canlı zayıflatılmış aşı (LAV). Zayıflatılmış virüsler vücutta çoğalabilir ancak patojenik değildir.
- Enfeksiyonu ortadan kaldırmak için kimyasal veya ultraviyole ile etkisiz hale getirilmiş virüsler içeren etkisizleştirilmiş virüs (IV) aşıları. Virüs parçacıkları tamamlanmış, bölünmüş veya saflaştırılmış olabilir (sadece antijenik proteinler).
- Viral vektör (VV) aşısı, patojenik bir virüsün antijenini sunan aktif, patojenik olmayan bir virüstür. Son zamanlarda geliştirilen bu yapılar gen terapisi uygulamaları için de kullanılmaktadır.
Virüs benzeri parçacık (VLP) aşıları, viral parçacıkların genel yapısını taklit eden ancak bulaşıcı genetik materyal içermeyen belirli bir viral alt birim aşı sınıfıdır.
Çoğu durumda, viral parçacıklar, viral aşının lizi sırasında bile (parçalanma genellikle daha saf bir ortamda, daha sonraki akışta gerçekleştirilir) berraklaştırma aşamasında tamamen sağlamdır.
Viral berraklaştırmanın temel zorluğu, hücre artıklarını, büyük agregaları ve çözünmeyen kirleticileri etkili bir şekilde uzaklaştırırken yüksek verimli viral partiküllerin geri kazanılmasıdır. Aşağıdaki bölümlerde açıklandığı gibi, virüs bozulmasına veya kaybına neden olabilecek birkaç faktör vardır. Ek olarak, özellikle LAV ve VV aşıları için, sürecin bu aşamasında viral kantitatif analiz yöntemlerinin yüksek değişkenliği nedeniyle viral verime güvenmek zor olabilir. Bu aşılar için, viral verim genellikle plak testi veya TCID 50 testi gibi enfeksiyözlük testleri kullanılarak değerlendirilir. Hasat edilen bileşiklerden bazılarının virüsün gösterge hücrelerini enfekte etme yeteneğine müdahale edebilmesi, bu kantitatif yaklaşımın değişkenliğini artırır.
2.2 Virüs aşısı açıklama stratejisi
Viral aşılar boyut, yapı, şekil ve ifade sistemleri açısından büyük farklılıklar göstermektedir (Tablo 3).
Sonuç olarak, özellikle berraklaştırma adımları olmak üzere, alt akış süreçleri için genellikle bir şablon yoktur. Teoride, mevcut tüm teknikler (düşük hızlı santrifüjleme, mikrofiltrasyon TFF, NFF) virüsü berraklaştırmak için seçilebilir ve potansiyel olarak birleştirilebilir. Aslında, berraklaştırma yöntemlerinin başarısı, ifade sistemi ve söz konusu virüslerin fizikokimyasal özelliklerinden etkilenir.
Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>Katyonik polimerler kullanan {{0}} hücre/ml) berraklaştırma yöntemi, geleneksel yöntemlere kıyasla derin filtrasyon alanını 4 kat azalttı. Bu teknik, santrifüj kullanmadan büyük kapasiteli fermentörlerin hasat edilmesine olanak tanır. Benzer şekilde, Riske ve arkadaşları, %1.4-2,6 katı içeren 40 L hücre kültürünün (%0,02) kitosan ile işlenmesinin, derin filtrasyondan sonra mutlak filtre kapasitesinde 7- kat artışa yol açtığını gösterdi.
Ayrıca kitosanın, tipik olarak santrifüjlerde çöken alt mikron parçacıklarını floküle ederek berraklaştırma verimliliğini artırdığından da bahsediyorlar. Ön işlem ve flokülasyon yöntemlerinin gelecekteki aşı filtrasyon berraklaştırmalarının bir parçası olmaya devam etmesi muhtemeldir. Şekerler, glikoller ve amino asitler dahil olmak üzere penetranlar, virüsleri tercihen floküle eder. Ozmotik çözelti ile viral flokülasyon ve ardından 0.2µ mikrofiltrasyon, virüs saflaştırması için kapsamlı bir işlem olarak kullanılabilir. Penetranlar, hidrofobik kapsüllenmemiş virüs parçacıklarını ve kapsüllenmiş virüs parçacıklarını floküle etmek için parçacıkların etrafındaki hidrasyon tabakasını azaltarak viral agregasyonu uyarabilir. Penetranların virüsleri floküle ettiği gösterilmiş olsa da, yöntem gelecekteki aşı saflaştırmaları için bir platform olma potansiyeline sahiptir ve pilot veya büyük ölçekli aşı saflaştırmasında uygulanabilirliği kanıtlanmamıştır. Gelecekteki aşı filtresi berraklaştırmasının bir parçası olmaya devam etmesi muhtemel olan flokülasyon ön işlem yöntemi, 2L'lik bir fermentörde gerçekleştirilir. Büyük ölçekli üretim operasyonlarında potansiyel olarak kullanılabilmeleri için, bu yöntemlerin pilot ve üretim ölçeklerinde doğrulanması gerekir.
2.2.1 Sistem etkisinin ifade edilmesi
Berraklaştırma yöntemi esas olarak, uzaklaştırılacak kirleticilerin türünü ve seviyesini belirleyen yukarı akış süreci ve ifade sisteminin türüne bağlıdır. Viral aşılar genellikle tavuk embriyolarında memelilerin veya kuşların sürekli hücre hatları veya daha karmaşık bir ifade sistemi olan bakülovirüs/böcek hücreleri tarafından üretilir. Bazı VLP tipleri ayrıca diğer heterolog ifade sistemleri (bakteri, maya, bitki hücreleri) tarafından da üretilebilir.
2.2.1.1 Tavuk embriyosunda üretilen virüs
Aşılar onlarca yıldır yumurtalarda üretilmektedir. Bu çalışma, Woodruff ve Good Pasture'ın verimli yumurtaların koryo-allantoik zarını viral büyüme için bir substrat olarak başarıyla kullandığı 1931 yılına dayanmaktadır. Günümüzde, birçok insan ve veteriner aşısı hala bu eski süreç kullanılarak üretilmektedir. Muhtemelen en bilineni mevsimsel grip aşısıdır. Prensip, tavuk yumurtalarını ilgi duyulan virüslerle aşılamak ve ardından koryo-allantoik zarda çoğaltmaktır. Üremeden sonra, viral parçacıklar açısından zengin olan allantoik sıvı toplanır ve saflaştırılır.
Alantoik sıvı zorlu bir berraklaştırma yemidir. Yüksek mineral ve protein içeriği (ovalbümin dahil) ona yüksek bir viskozite kazandırır. Alantoik sıvı ayrıca tüyler, gagalar, kan damarları veya kan hücreleri gibi tavuk embriyosundan elde edilen temel doku bileşiklerini de içerir. Yüksek katı içeriği nedeniyle, düşük hızlı santrifüjleme birincil berraklaştırma için tercih edilen seçenektir ve genellikle yaklaşık %70'lik bir geri kazanım oranıyla sonuçlanır. Ancak, filtrasyon teknikleri kullanılarak birincil berraklaştırma da mümkündür. NFF için, polipropilen ve selüloz bazlı derin filtreler iyi alantoik sıvı toplama yeteneklerine sahiptir. Polipropilen veya selüloz bazlı derin filtrelerden yapılan yüzey filtreleri 150-210 L/m² kapasiteye sahip olabilir ve besleme akışı bulanıklığını 3 kata kadar azaltabilir. Açık besleme kanallı TFF cihazı, cihaz besleme kanalından minimum basınç kaybı için daha uygun olduğundan ve böylece kanal tıkanıklığını azalttığından, alantoik sıvı berraklaştırması için de uygundur.
İkincil berraklaştırma adımı NFF ile kolayca yapılabilir. Polipropilen, selüloz ve cam elyaf malzemelerin bir kombinasyonu genellikle iyi verimlilik gösterir ve ikincil berraklaştırma adımına bir alternatif olarak TFF ve {{0}}.65μm veya 0.45μm mikrofiltrasyon membran cihazı kullanmak ve ozmotik akı kontrolü çalıştırmaktır. Bu adımda hidrofilik PVDF veya hidrofilik PES membranlı açık kanallı bir TFF cihazı kullanılabilir.
Viral partiküllerin çözünmeyen döküntü materyaliyle ilişkili olabileceğini ve bu durumun berraklaştırma sırasında viral üretimi önemli ölçüde azaltabileceğini belirtmek önemlidir. Tuz çözeltisi kullanmak, influenza virüsleri ve katı parçalar arasındaki bu ilişkiyi azaltabilir ve viral partiküllerin bütünlüğünü etkilemeden üretimde yaklaşık iki kat artışla sonuçlanabilir.
2.2.1.2 Ardışık memeli ve kuş hücre hatlarında üretilen virüsler
Son zamanlarda, bazı viral aşılar yumurta bazlı süreçlerden uzaklaşarak hücre kültürü bazlı süreçlere yönelmiştir (özellikle grip aşıları için). Bu geçişin temel nedeni embriyonik yumurtalarla ilişkili aşı üretim sorunlarını önlemektir (yani herhangi bir kümes hayvanı hastalığı salgını durumunda ortaya çıkabilecek yumurta tedarikinde eksiklik). Sonuç olarak, birçok aşı türü ve viral vektör şu anda memelilerden veya kuşlardan sürekli hücre hatları, geleneksel hücre hatları (Vero, MDCK veya HEK293 hücre hatları gibi) veya tescilli hücre hatları kullanılarak geliştirilmektedir.
Virüs, ifade sistemine bağlı olarak hücrenin içinde kalabilir ve hücre lizis adımı gerektirebilir veya hücrenin dışında kalabilir (lizis veya tomurcuklanma). Hücre kültüründen elde edilen katı yük ve çözünür içerik, allantoik sıvı fazdan çok daha temizdir. Sonuç olarak, NFF teknolojisinin uygulanması daha kolaydır ve kapasite önemli ölçüde daha yüksektir. Ancak, filtrasyon kapasitesi, hücre yoğunluğu veya hasattaki hücre canlılığı gibi hücre kültürü koşullarına büyük ölçüde bağlıdır. Bu parametreler, derin filtreleri ve membranları tıkayabilen hücre artıkları ve makroagregatların miktarını etkiler ve bu da kapasitenin azalmasına neden olur.
Thomassen ve diğerleri NFF berraklaştırmasının iyi bir örneğini sunar. İnaktif poliovirüs (IPV) üretim sürecinde kullanılır. Mikro taşıyıcılar üzerinde kültürlenen Vero hücreleri, {{0}}.78 x 106 hücre / ml TOI hücre yoğunluğuna sahip viral çoğalma için kullanıldı. Hasattan mikro taşıyıcıları çıkarmak için ön berraklaştırma için 75 μm paslanmaz çelik bir elek kullanılır. Çift katmanlı sınıflandırma, bir yoğunluk derin filtresi (0.2-2.0 μm) kullanılarak berraklaştırılır, ardından sterilize edilmiş bir sınıf filtresi gelir.
Seçilen ölçeklenebilir tek kullanımlık ünite, 350 L ölçekte Sabin IPV klinik deneme materyalinin hazırlanmasında başarıyla kullanıldı. Virüs serotipine bağlı olarak, %{1}} ila %96 arasında bir virüs kurtarma oranı elde edildi.
2.2.1.3 Böcek hücre sisteminde üretilen bakulovirüs/virüs benzeri parçacıklar
Büyük ölçekli aşı üretimi için bakulovirüs/böcek hücre sistemlerinin dikkate alınması nispeten yenidir, ancak viral vektörler ve VLP'ler alanında giderek artan bir ilgi görmektedir. Bu sistemin temel faydası, kısa ömürlü (hücre hatları oluşturmaya gerek yok) ve güvenli (tam viral DNA yok) üretimi içermesidir. Bakulovirüsün uzaklaştırılması ve ürün stabilitesi gibi bazı dezavantajları da vardır.
GlaxoSmithKline tarafından üretilen insan papilloma virüsü enfeksiyonuna karşı bir VLP aşısı olan Cervarix, böcek hücrelerinde ticari olarak üretilen ilk insan aşısıdır. Bakülovirüsle enfekte olmuş böcek hücrelerinde üretilen VLP'lere ve rAAV vektörlerine dayalı bir dizi aşı şu anda geliştirilme aşamasındadır. Sonbahar ordusu kurdu Spodoptera frugiperda'dan (Sf9 ve Sf21) ve lahana kıvrık kurdu Trichoplusia ni'den (BTI-TN5B1-4 hücreleri) türetilen böcek hücre hatları, süspansiyonda büyüme kabiliyetleri nedeniyle en yaygın kullanılanlardır; bu da yukarı akış sürecinin amplifikasyonunu basitleştirir. İstenilen canlı hücre yoğunluğuna ulaştıktan sonra, bu hücreler protein ekspresyonu için üstel hücre büyüme fazında rekombinant bakülovirüs ile enfekte edilir. Bakülovirüslerin geniş genomu, VLP ve viral vektörlerin karmaşıklığına uyan beş veya daha fazla farklı proteinin ekspresyonuna izin verir.
Bernard ve diğerleri böcek hücre kültürünün alt akış sürecini tanımladı. Süreç oldukça değişkendir ve bu teknikle üretilen proteinlerin çeşitliliğini yansıtır. Saflaştırma dizisinin ilk adımı biyoreaktörün hacim özelliklerinden (yani hücre yoğunluğu ve canlılığı) veya ürün salınımının doğasından (tomurcuklanma veya hücre lizisiyle salgılanır) büyük ölçüde etkilenir. Böcek hücrelerinin bakülovirüs enfeksiyonu 3-5 gün içinde hücre lizisine neden olabilir. Hücrelerin tahribi proteolitik aktivitede artışa ve rekombinant proteinlerin bozulmasına yol açabilen diğer çevresel faktörlere yol açabilir.
Hücre lizi başlatma yeteneği daha düşük olan bakülovirüsler geliştirme girişimleri olmuştur. Bakülovirüs enfekte böceklerin yüzde 10'undan daha azını lize eder.
Hücre lizi, dondurma-çözme, deterjanlar, homojenizatörler veya ultrason tedavisi gibi farklı yöntemler kullanılarak gerçekleştirilebilir. Böcek hücrelerinin hücre duvarı yoktur ve bu nedenle hızla çözünürler. Ultrasonik tedavi birçok tezgah prosesinde bildirilmiş olsa da, deneysel veya ticari ölçekte nadiren kullanılır. En yaygın yöntem, düşük konsantrasyonlu bir deterjan (0.1% Triton X-100 veya NP-40) varlığında hücreleri yok etmek için bir homojenizatör kullanmaktır. Deterjanların ve mikroakışkanlaştırma veya ozmotik darbe homojenizasyonunun kullanımı birçok büyük ölçekli üretim prosesinde başarıyla kullanılmıştır. Tipik olarak, böcek hücreleri lizis tamponlarında (50 mM TRIS pH7.7, 300 mM NaCl, %5 gliserol, 0.2 mM PMSF ve proteaz inhibitörleri) süspanse edilir, bu sırada Triton-X100 %0.1'lik bir son konsantrasyona eklenir ve ardından hafif ultrason veya mikroakışkanlaştırma yapılır. Daha sonra karışım santrifüj edilerek çözünmeyen parçacıklar uzaklaştırılır.
Bu aşamada, lizat çok bulanık görünebilir ve 0.45μm filtre kullanılarak filtrelenmesi zordur. Bazen piroliz berraklaştırma adımı sırasında %30'a kadar kayıplar gözlemlenebilir. Ayrışma aşamasında benzoenzimlerin eklenmesi, filtrasyon sorununu çözmeye yardımcı olur. Hasattan sonra hücreleri fosfat tamponlu tuzlu suyla temizlemek ve çatlama tamponu içeren yüksek tuzlu (500mM NaCl) bir ortamda hızlı "dondurma-çözme" yapmak, agregaları gidermeye yardımcı olur.
Böcek hücreleri tarafından üretilen VLP'lerin ve viral vektörlerin berraklaştırılması, yalnızca viral partiküllerin değil aynı zamanda büyük miktarda hücresel nükleik asidin de salındığı hücre lizisi (kimyasal veya mekanik işlemle) sonrasında gerçekleşir. Böcek hücreleri, 1-9.10 6 hücre/ml'den başlayan yüksek hücre yoğunluğunda büyüyebilir. Bu nedenle berraklaştırma adımı, yüksek hücre yoğunluğu, yüksek nükleik asit içeriği ve mümkünse bakülovirüs partiküllerinin uzaklaştırılmasıyla ilgilenmelidir. İşleri daha da karmaşık hale getirmek için, VLP'ler veya viral vektörler ve bakülovirüsler benzer boyutlara sahip olabilir (bakülovirüsler 60-80 nanometre genişliğinde ve 300-400 nanometre uzunluğundadır). Yüksek hücre yoğunluğu nedeniyle, santrifüjleme onlarca yıldır birincil berraklaştırma için tercih edilen teknik olmuştur. Ancak, ölçeklenebilirliğin tanımlanması kolay olduğundan membran prosesleri çok çekici bir alternatif gibi görünmektedir.
Derin filtreler, üç katmanlı rotavirüs benzeri parçacıkların aşağı akış sürecinde etkili bir şekilde kullanılmıştır. Laboratuvar düzeyinde, CsCl yoğunluk gradyanı ultra santrifüjleme yöntemi genellikle bu karmaşık parçacıkları saflaştırmak için kullanılır. Araştırmacılar yalnızca derin filtrenin berraklaştırma adımını değil, aynı zamanda tüm aşağı akış sürecini (Triton X-100 ayrımı ve derin filtrasyon, ardından ultra filtrasyon ve parçacık boyutu dışlama) değerlendirdi. Sonuçlar, CsCl yoğunluk gradyanının veriminin %37'ye ulaşabileceğini göstermektedir.
Ultra santrifüj yöntemi yaklaşık %1'dir. Başka bir örnek olarak, böcek hücrelerinde üretilen HIV benzeri parçacıkları geri kazanmak ve yoğunlaştırmak için 0,45 μm içi boş lifler ve 500 kDa ince çaplı lifler kullanıldı. Bu çalışmada, içi boş liflerin kayma kuvveti hücre bütünlüğüne göre optimize edildi. Sonuçlar Sofra şekeri gradyanlı ultra santrifüjlemenin yerini alacak düşük kayma kuvveti işlemi oluşturuldu.
İşlemin seri üretime uygulanma potansiyeli vardır. Derin filtreler ayrıca rekombinant adeno ilişkili virüslerin üretiminde de başarıyla kullanılmıştır. Hücre lizi, iki pistonlu mekanik hücre sıkıştırıcı ile gerçekleştirilmiş ve ardından nükleaz işlemi uygulanmıştır. Berraklaştırma adımında, 1,2 μm cam elyaf derin filtre elemanı kullanılmış ve ardından iki katman 0.8 μm hidrofilik PES ve 0.2 μm hidrofilik PES uygulanmıştır. Orantılı boyutlu filtreler, daha küçükten 200 L boyutlarına kadar olan işlem grupları için kullanılır. Derin filtreler başarıyla kullanılmış ve 0,2 µm veya 0,45 µm düz filmler veya içi boş elyaflarla TFF derecelendirmelerinin de çok etkili olduğu bildirilmiştir.
Portekiz'deki Oeiras Deneysel Biyoloji Enstitüsü'ndeki Tecnologica (IBET) tarafından yapılan çalışmada, santrifüjleme olmaksızın bakulovirüsler tarafından ifade edilen hepatit C VLP'nin berraklaştırılmasını gerçekleştirmek için NFF kullanılmıştır. Nominal olarak derecelendirilmiş polipropilen filtreler (10,5,0.6 ve 0.3μm) VLP hasadını berraklaştırmak için kullanılır. 0.6μm ve 0.3μm gözenek derecelerine sahip aynı filtreler, VLP hasat merkezlerinde filtrasyon için kullanılır. İncelenen tüm filtratlar HCV-VLP geri kazanım oranları açısından test edildi ve önerilen filtrasyon yöntemleri karşılaştırıldı. Sonuçlar Tablo 4'te gösterilmiştir.
Sonuçlar, 5μm-0.3μm filtrenin doğrudan hasat edilen hepatit C VLP beslemesi için en yüksek ürün geri kazanımına (%100) sahip olduğunu gösterdi. Polipropilen 0.6μm filtre, merkezi besleme için en yüksek ürün geri kazanımına (%82) sahipti ve konak hücrenin DNA temizliği yaklaşık %70 idi.
2.2.1.4 Bakteriyel veya maya sistemlerinde üretilen virüs benzeri parçacıklar
Bakteriyel veya maya sistemlerinde ifade edilen VLP aşıları için arıtma yönteminin türü, VLP'nin hücre dışı medyatörlere salınmasına bağlıdır. VLP'ler verimli bir şekilde salgılanamıyorsa, gerçek arıtma adımından önce hücre lizisi veya diğer çıkarma adımları gerekebilir. Bu, protein arıtma endüstrisinde altın standart olsa da, bakteri veya maya bazlı sistemlerde ifade edilen santrifüjleme (sürekli veya parti), daha yakın zamanda, membran prosesleri ölçeklenebilirlik kolaylığı ve tek kullanımlık tedavilerle uyumluluğu nedeniyle çok çekici bir alternatif haline gelmiştir.
Richter ve Topell, berraklaştırılmış E. coli'de üretilen VLP'leri hazırlarken santrifüjleme, TFF veya her ikisinin bir kombinasyonunun kullanımını açıklıyor. Çalışmalarında, homojenize edilmiş E. coli homojenatlarını 5 derece sıcaklıkta seyreltmek ve berraklaştırmak için 0.45m TFF membranları kullanıldı. Ayrıca, membran bazlı TFF'nin, tercihen açık kanal yapılandırmalarına sahip TFF üniteleri kullanılarak yüksek viskoziteli hasatların işlenmesi için uygun olduğunu belirtiyorlar.
Santrifüjlü berraklaştırma da TFF'ye bir alternatif olarak değerlendirilmiştir. Bu durumda, elde edilen homojenat seyreltilmemiş ve 4 derecede 105 dakika, 10000g santrifüj edilmiştir. Yumuşak kaplama aktarılmadan, üstteki sıvı parçacıklardan dökülmüş ve 4 derecede ve 10.000 g'de 60 dakika boyunca tekrar santrifüjlenmiştir. Üstteki sıvı daha sonra mevcut parçacıklardan çıkarılmış, EB tamponuyla (43,89 mM Tris HCl, 6,11 mM Tris Base, 5,0 mM EDTA, %10 (v/v) Triton X-100) 1:2 oranında seyreltilmiş ve 0,22 m steril filtre cihazında filtrelenmiştir. Daha fazla işleme. Bu VLP aşısının E. coli'de 800L ölçekte üretimine yönelik ölçek büyütme sürecinin de santrifüjleme ve TFF kombinasyonuyla açıklığa kavuşturulduğu bildirildi.
Rekombinant hepatit E aşısı HEV 239, 16 yaş ve üzeri yetişkinlerin bağışıklanması için Çin'de lisanslanmıştır. Aşı antijenleri (VLP), E. coli'de ifade edilir ve antijen üretim sürecinin ölçeklendirilmesinin 50L ölçeğinde olduğu gösterilmiştir. Ürün, E. coli'nin çatlatılmasıyla çıkarıldı ve inklüzyon gövdeleri, %2 Triton X-100 içeren bir tamponla ağır yıkama yoluyla hücre parçalarından ayrıldı ve ardından 4 M üre homojenizatörü ile çözüldü. TFF, Saccharomyces cerevisiae'de üretilen insan papilloma virüsü VLP'sini berraklaştırır (15L). Nükleazla işlenen hücre lizatı, 0,65 μm içi boş fiber filtre kullanılarak transfiltrasyon modunda çapraz akışlı mikrofiltrasyonla berraklaştırıldı. Aynı işlem aşı üretiminde de kullanılır. VLP bazlı aşıların yalnızca bir kısmı ticari ölçeğe ulaşmış olsa da, çoğu santrifüjleme veya membran teknolojisi kullanılarak berraklaştırılan birkaç VLP bazlı aşı geliştirilme aşamasındadır.
Mekânın etkisiyle sınırlı olarak, içeriğin ikinci yarısını bir sonraki bölümde paylaşacağız. Bir sonraki yazıda, aşı berraklaştırma ve ilgili membran bileşenlerinin kullanımına ilişkin bazı vakaları paylaşacağız.
Yerelleştirme devresindeki ilk şirket olarak Guidling Technology, aşı berraklaştırma konusunda yeterli ilgili deneyim biriktirmiştir. Guidling Technology, biyofarmasötik ve hücre kültürü, saflaştırma ve ayırmaya odaklanan bir geliştirme ve üretim şirketidir. Ürünler biyomedikal, tanı, endüstriyel sıvı filtrasyonu, tespit, berraklaştırma, saflaştırma ve konsantrasyon işlemlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır; Guidling, biyofarmasötik ve hücre kültürünün uygulama senaryolarını tam olarak karşılayan ultrafiltrasyon santrifüj tüpü, ultrafiltrasyon/mikrofiltrasyon membran kaseti, virüs giderme filtresi, teğetsel akış filtre cihazı, derin membran yığını vb. başarıyla geliştirmiştir.
Membranlarımız ve membran filtrelerimiz, ön filtrasyon, mikrofiltrasyon, ultrafiltrasyon ve nanofiltrasyonun konsantrasyonu, ekstraksiyonu ve ayrılmasında yaygın olarak kullanılır. Küçük tek kullanımlık laboratuvar filtrasyonundan üretim tipi filtrasyon sistemlerine, sterilite testine, fermantasyona, hücre kültürüne ve daha fazlasına kadar geniş ürün yelpazemiz, test ve üretim ihtiyaçlarını karşılayabilir.