UygulamaUltrafiltrasyonEçıkarmaNdoğalCollajen

 

Ⅰ.Kolajen nedir

Kolajen, hayvanların bağ dokusunun ana bileşeni olan bir biyopolimerdir ve aynı zamanda memelilerde en bol bulunan ve en yaygın şekilde dağıtılan fonksiyonel proteindir; toplam proteinin %25-30'unu ve hatta bazılarında %80'den fazlasını oluşturur. organizmalar. Hayvan hücrelerinde doku bağlama görevi görür.

Ölçüme göre bir yetişkinin vücudunda yaklaşık 3 kg kolajen bulunur ve bu kolajen esas olarak deride, kemiklerde, gözlerde, dişlerde, tendonlarda, iç organlarda (kalp, mide, bağırsak ve kan damarları dahil) ve diğer kısımlarda bulunur. insan vücudunun. Görevi derinin ve organların morfolojisini ve yapısını korumaktır ve aynı zamanda hasarlı dokuların onarımı için de önemli bir hammaddedir.

II. Ot Sazanı Ölçeğinden Ultrafiltrasyon ile Kollajenin Ekstraksiyonu

1. Malzemeler ve yöntemler

1.1 Test numuneleri

Ham kolajenin sulu ekstraktı.

1.2 Test yöntemleri

1.2.1 Ultrafiltrasyon işlemi

1.2.2 Ön filtreleme işleminin belirlenmesi

Bu testte, vakumlu filtreleme yöntemi ile mikrofiltrasyon yönteminin karşılaştırmalı analizi yoluyla en uygun ön filtreleme işlemi belirlenir. Spesifik test yöntemleri aşağıdaki gibidir:

① Ham kolajen sulu ekstraktı, sulu ekstrakttaki askıda kalan parçacıkları ve yabancı maddeleri çıkarmak için bir filtre kağıdı vakumlu filtreleme yöntemiyle filtrelenir.

② Ham kolajen sulu ekstraktı, sulu ekstrakttaki çözünmeyen maddeleri, safsızlıkları vb. çıkarmak için bir 0,2 μm mikrofiltrasyon membranı ile filtrelenir.

1.2.3 Ultrafiltrasyon membranı gözenek boyutunun seçimi

Saflaştırma sırasında ultrafiltrasyon membranının gözenek boyutu 100 kDa'dır.

1.2.4 Ultrafiltrasyon saflaştırma işleminin tek faktörlü deneyi

Ham kolajenin sulu ekstraktı, ultrafiltrasyon teknolojisi ile saflaştırılır. Çalışma basıncının, çalışma sıcaklığının ve pH'ın kollajen tutulması üzerindeki etkisine ilişkin tek faktörlü deneyi inceleyin. Ultrafiltrasyon ekipmanını bir süre çalıştırdıktan sonra çeşitli faktörlerin kollajen tutma oranı üzerindeki etkisini inceleyin.

1.2.5 Hesaplama Formülü

2. Sonuçlar ve Analiz

2.1 Ön filtreleme proses analizi

Vakumlu filtreleme yöntemi ile mikrofiltrasyon yönteminin karşılaştırma sonuçları için aşağıdaki tabloya bakın.

Filtrasyon Yöntemi	Filtrasyon Öncesi Çözelti Konsantrasyonu/(g/L)	Filtrasyon Sonrası Çözelti Konsantrasyonu/(g/L)	Duyusal Olaylar
vakumlu filtreleme yöntemi	0.45	0.35	Filtrasyon sonunda çözelti berraktır ancak bir süre bekletildikten sonra bulanıklaşır.
mikrofiltrasyon yöntemi	0.45	0.42	Çözelti filtrasyon sonunda berraktır ve bir süre bekletildikten sonra da berrak kalır.

 

Tablodan hem vakum filtrasyon yönteminin hem de mikrofiltrasyon yönteminin çözeltideki yabancı maddeleri ve çözünmeyen katıları giderebildiği ancak mikrofiltrasyon yönteminin protein üzerinde daha iyi koruma etkisine sahip olduğu, yani kaybın önemli olmadığı ve vakumlu filtreleme yöntemi protein kayıplarına neden olabilir. Ayrıca, filtrat vakumlu filtrasyon ile bir süre bekletildikten sonra bulanık hale gelirken, mikrofiltrasyon hala berrak ve şeffaftır, bu nedenle ultrafiltrasyonun ön arıtma işlemi olarak mikrofiltrasyon seçilmiştir.

2.2 Ultrafiltrasyon işleminin tek faktörlü testi

2.2.1 Ultrafiltrasyon basıncının tutma oranına etkisi

40 derece sıcaklık ve 9.0 pH koşulu altında, farklı ultrafiltrasyon basınçlarının (0.07MPa, 0.{) etkilerini inceleyin. {11}}9MPa, 0,11MPa, 0,13MPa ve 0,15MPa) protein tutma oranı üzerinde. Sonuçlar aşağıdaki şekilde gösterilmektedir.

 

Yukarıdaki şekilde görüldüğü gibi çalışma basıncının artmasıyla birlikte protein yakalama oranı giderek azalmıştır. {{0}}.07MPa'da protein tutma oranı %96,53, çalışma basıncı 0,15MPa olduğunda protein tutma oranı %84,38'dir. Bunun nedeni, maddelerin ultrafiltrasyonla ayrılmasının basınç farkından kaynaklanmasıdır. Bu düşük çalışma basıncı aralığında, küçük moleküler maddeler membrandan hızlı bir şekilde geçebilir, ancak makromoleküler maddeler ultrafiltrasyon membranı tarafından yakalanabilir ve membranın yüzeyinde ve şu anda membranın yüzeyinde ve sulu ortamda birikebilir. Konsantrasyon farkı polarizasyon direncine neden olmak için konsantrasyon farkını çıkarın; ancak basıncın artmasıyla konsantrasyon polarizasyon direnci giderek artar ve membran yüzeyi ile sulu ekstrakt arasındaki konsantrasyon farkı dengeye ulaşır. Basınç bu dengeyi aştığında, membran yüzeyine bir jel tabakası yazılabilir (bu, konsantrasyon polarizasyonu teorisi ve ultrafiltrasyon sırasında oluşan jel tabakası ile tutarlıdır). Basınç artmaya devam eder, jel tabakasının kalınlığı artar ve membran yüzeyinde kalan protein artar, bu da düşük tutma oranına neden olur. Membranın ayırma etkisini sağlamak için optimum çalışma basıncı parametresi 0,07MPa'dır.

2.2.2 Sıcaklığın protein tutma oranı üzerindeki etkisi

{{0}}.11MPa, pH 9.0 basınç koşulu altında, farklı sıcaklıkların (25 derece, 30 derece, 35 derece, 40 derece ve 45 derece) protein tutulması üzerindeki etkilerini inceleyin. Sonuçlar aşağıdaki şekilde gösterilmektedir.

 

Yukarıdaki şekilde görüldüğü gibi sıcaklığın artmasıyla birlikte ultrafiltrasyon membranının tutma oranı giderek artmakta ve 45 derecede maksimuma ulaşarak tutma oranı %97,01 olmaktadır. Çünkü kolajenin viskozitesi sıcaklıkla yakından ilişkilidir: sıcaklık daha düşük olduğunda, kolajenin viskozitesi daha büyüktür ve dolayısıyla kolajenin membran yüzeyinde direnç oluşturması kolaydır, bu da düşük tutma oranına neden olur. Sıcaklık arttığında kollajenin viskozitesi azalır ve kollajen molekülleri arasındaki etkileşim zayıflar, böylece kütle aktarım hızı artar ve konsantrasyon polarizasyonu zayıflar, böylece tutma oranı artar. Tutma oranının artmasının bir diğer nedeni ise sıcaklığın artması ve buna bağlı olarak kolajenin çözünürlüğünün artması ve kolajenin zarı bloke etme olgusunun azalmasıdır. Bu nedenle ultrafiltrasyon için en uygun sıcaklık 45 derecedir.

2.2.3 pH'ın protein tutulması üzerindeki etkisi

{{0}}.11MPa basınç ve 40 derece sıcaklık koşulu altında, farklı pH koşullarının, yani pH=6.0, pH{ {5}}.{{10}}, pH=8.0, pH=9.0 ve pH=10.0, tutma oranına göre . Sonuçlar aşağıdaki şekilde gösterilmektedir.

 

As shown in the above figure, within the pH value range of 6–7, with the increase of pH value, the protein retention rate decreases, and there is a minimum value of 82.13% at pH=7.0. When pH>7, with the increase of pH value, the retention rate gradually increases. This is because the isoelectric point of collagen pH=7, at the isoelectric point of protein is a precipitation state, easy to stay on the surface of the membrane block membrane, so that the retention rate is low; When pH>Şekil 7'de pH'ın artmasıyla birlikte tutma oranı kademeli olarak artmaktadır. Bunun nedeni, ultrafiltrasyon membranının negatif yüklü polieter akçaağaç membranı olması, alkali koşullar altında negatif yüklü kollajen olması, negatif yüklü kollajen molekülleri ve aynı yüke sahip ultrafiltrasyon membranının birbirini dışlayan bir durum oluşturmasıdır, böylece kollajen moleküllerinin yüzeyde kalması kolay değildir. Membranın bloke edilmesi kolay değildir, dolayısıyla ultrafiltrasyonun optimal pH'ı 8-10'dir.

2.3 Ultrafiltrasyon Süreci Optimizasyonu ve Sonuçların Doğrulanması

Design-Expert8.05 yazılımı tarafından yapılan analiz, optimum proses parametrelerinin şu şekilde olduğunu göstermektedir: çalışma basıncı 0.14MPa, çalışma sıcaklığı 40,98 derece ve çözelti pH'ı=9.43. Bu koşullar altında tutma oranı %92,551 idi. Gerçek parametrelerin çalışabilirliği göz önüne alındığında, ultrafiltrasyon koşullarında çalışma basıncı 0,14MPa, çalışma sıcaklığı 40 derece ve besleme sıvısının pH değeri 9,50'dir. Ultrafiltrasyon cihazının sisteminin stabil hale gelmesinin ardından deneysel doğrulamaya geçilir. Elde edilen elde tutma oranı sonucu (92.61 0.1)% (n=3)'dir. Denklemin tahmin edilen değeri temel olarak ölçülen değere benzer, bu da tahmin edilen koşullu parametre sonucunun gerçek koşullu sonuca uygun olduğunu gösterir.

2.4 Elektroforez analiz sonuçları

Saflaştırılmış kolajen SDS-PAGE elektroforezi ile analiz edilir ve sonuçlar aşağıdaki şekilde gösterilmektedir.

Yukarıdaki şekilde gösterildiği gibi şerit 1, bu deneydeki saflaştırılmış kolajendir ve şerit 2, baldır tendonunun standart kolajen numunesidir. SDS-PAGE elektroforezinden, bu deneyde önerilen kolajen proteininin kolajen olarak tanımlanabileceği görülebilmektedir ancak a1 peptid zinciri ve a2 peptid zincirinin görünürde belirsiz sınırları açık değildir. Elektroforezden başka protein bantlarının olmadığı açıkça görülmekte ve saflaştırılmış kolajenin saflığının yüksek olduğu sonucuna varılabilmektedir.