İnsan Kuduz Aşısı Üretiminde Ultrafiltrasyon Uygulaması

İnsan kuduz aşısının üretiminde ultrafiltrasyon uygulamasını teşvik etmek amacıyla, kuduz virüsü hasat solüsyonunu konsantre etmek ve ultrafiltrasyon sonrasında antijen geri kazanımını, endotoksin giderme oranını ve konakçı protein giderme oranını tespit etmek için 300kDa ultrafiltrasyon membran kaseti kullanıldı. Sonuçlar, uygun basınç altında kuduz virüsü hasat solüsyonunun 80 kez konsantre edildiğini, 25 kez elüe edildiğini, antijen geri kazanım oranının %86.2, bakteriyel endotoksin giderme oranının %87.5 ~ %88.7 olduğunu ve konakçı protein uzaklaştırma oranı %91.6 idi.

 

Önsöz

 

Kuduz, Kuduz Virüsünün (RV) neden olduğu, ölüm oranı %100'e varan geleneksel, eski bir zoonotik hastalıktır. Şu anda, acil aşı ve immünoglobulin aşılaması dışında, maruz kalma sonrası (yani cilt ve mukoza zarlarında hasar) etkili bir tedavi yoktur. İnsanlarda kuduz hastalığının ana kaynağı, hastalıklı ya da potansiyel olarak enfekte hayvanların (özellikle köpekler) ısırıklarıdır. Çin'de kuduzdan ölüm oranı dünyada ikinci sırada yer almakta olup, kuduz ülkemizde halk sağlığı güvenliğini tehdit eden sorunların başında gelmektedir. Koruyucu nötrleştirici antikor üretimini indükleyen tek anahtar antijen olan kuduz virüsünün kapsüler glikoproteini, kuduz virüsüne yönelik yeni aşıların ve yeni teşhis ve tedavi teknolojilerinin araştırma ve geliştirmesinin odak noktası olmuştur.

 

Kuduz virüsü, rabdovirüs ailesinin kuduz virüsü cinsine aittir. Nükleokapsitin şekli elastiktir, nükleokapsit sarmal olarak simetriktir ve yüzeyi tek sarmallı RNA içeren bir zarfa sahiptir. Kuduz hastalığına neden olan patojendir. Kuduz virüsünün iki ana antijeni vardır: Biri, virüsün dış zarında bulunan, asetilkolin reseptörüne bağlanarak virüsü nörotoksik hale getirebilen ve vücutta nötralize edici antikorlar ve hemaglutinasyonu inhibe eden antikorlar üretebilen glikoprotein antijenidir ve nötralize edici antikorlar, koruyucu bir etki; Diğeri ise vücudun kompleman bağlayıcı antikorlar ve çökelti üretmesini sağlayan ve koruyucu etkisi olmayan iç riboprotein antijenidir.

 

Endotoksin, ısı direncine ve kimyasal stabiliteye sahip olan ve yok edilmesi kolay olmayan bir tür lipopolisakkarit maddedir (LPS). Aşıda belirli bir konsantrasyonda endotoksin varsa, aşı sonrası şiddetli ateşe ve hatta ölüme neden olacağından aşıdaki endotoksin içeriğinin mümkün olduğu kadar azaltılması gerekir. Çin Farmakopesi'nin 2005 baskısı (Bölüm III), kuduz aşısı endotoksininin nitelikli indeksinin kontrol değerinin 100EU/dozdan yüksek olmaması gerektiğini belirlemiştir. Membran ayırma teknolojisinin hızla gelişmesiyle birlikte, aşılardaki endotoksin içeriğini azaltmak için ultrafiltrasyon membran ayırma teknolojisinin uygulanması ilaç endüstrisinde giderek yaygınlaşmaktadır.

 

Kuduz aşısı kuduz hastalığına karşı uygulanan bir aşıdır. Saflaştırılmış Vero hücre aşısı, insan diploid hücre aşısı ve birincil hücre kültürü aşısı dahil olmak üzere genellikle üç tür kuduz aşısı vardır. Kuduz aşısı, kuduz virüsü sabit virüsünün kültür, hasat, konsantrasyon, inaktivasyon, saflaştırma ve uygun stabilizatörün eklenmesinden sonra hücresel matrise aşılanmasıyla yapılır. Kuduz aşısının ana işlevi, virüsün neden olduğu enfeksiyonu önlemek ve hastalık riskini azaltmak için vücudu hızlı bir bağışıklık tepkisi üretmeye ve kuduz virüsüne karşı koruyucu antikorlar üretmeye teşvik etmektir.

 

 

Aşının üretim süreci, aşının kalitesinin sağlanmasında önemli bir rol oynamaktadır, özellikle üretim sürecindeki bazı göstergelerin nicelikselleştirilmesi daha önemlidir. İnsan kuduz aşısının üretim sürecinde, ultrafiltrasyon konsantrasyon teknolojisi, insan kuduz aşısının üretilmesi için gerekli bir araçtır. Ultrafiltrasyon konsantrasyonu için makul açıklıklı ultrafiltrasyon membranının kullanılması, endotoksini ve konakçı proteini etkili bir şekilde ortadan kaldırabilir ve aşı üretimine ve kalite iyileştirmesine yardımcı olan RV antijenini koruyabilir. RV moleküllerinin göreceli moleküler kütlesi 350kDa ~ 460kDa'dır ve teorik olarak RV, 100kDa ve 300kDa'lık müdahale moleküler ağırlığına sahip membran kaseti kullanılarak ultrafiltrasyon konsantrasyonuyla tamamen yakalanabilir. Endotoksin sıklıkla farklı sulu çözeltilerde agregat yapı oluşturur, agregasyon derecesi nedeniyle moleküler boyut farklıdır. Endotoksin monomerinin bağıl moleküler kütlesi 10kDa ~ 20kDa'dır ve polimerizasyon formunun bağıl moleküler kütlesi 300kDa ~ 1000kDa veya 1000kDa'dan fazladır. Moleküler ağırlıktaki farklılığa bağlı olarak, insan kuduz aşısındaki RV antijeni tutuldu ve insan kuduz aşısındaki endotoksin ve konakçı protein, 300kDa ultrafiltrasyon membranı ile uzaklaştırıldı.

 

Bu deneyde, 300kDa açıklığa ve 0,11 m2 membran alanına sahip ultrafiltrasyon membran kaseti, insan kuduz aşısı ara ürünlerini konsantre etmek için küçük numune tedavisi olarak kullanıldı ve membran akışı, tedavi verimliliği, çoklu konsantrasyon, antijen müdahalesi, endotoksin giderme ve konakçı protein giderimi test edildi.

 

2Malzeme Yöntemi

 

2.1 Deneysel malzemeler

Kuduz virüsü sabit virüs CTN-IV suşu; Vero hücreleri; 0.5M sodyum hidroksit; 300kDa ultrafiltrasyon membran kaseti (PES malzemesi, 0,11m² membran alanı).

 

2.2 Deneysel yöntemler

2.2.1 Virüs toplama solüsyonunun hazırlanması

Dondurulmuş Vero hücreleri, 37 derece ~ 39 derece sıcaklıktaki ılık suda yeniden canlandırıldı, hücre süspansiyonu yudumlanarak çıkarıldı ve daha sonra %10 inaktif buzağı serumu içeren 199 kültür ortamına eklendi. Tekdüze tek katmanlı hücreler 37 derecede kültürlendi. CTN-IV suşu, 0.1mol/L oranında kuduz virüsü ile aşılandı ve 37 derecede kültürlendi. 48 saat sonra kültür ortamı atıldı ve kültürü 33 derece ila 35 derece arasında tutmak için %0.1 insan kanı albümini içeren 199 kültür ortamı eklendi. Hastalık zehirini her 3 günde bir{16}}hasat edin ve birden fazla hasat sıvısını birleştirin.

 

2.2.2 Membran Kasetinin Takılması

Membran kasetini takın ve kabloları aşağıdaki şekilde gösterildiği gibi bağlayın.

 

2.2.3 Suyla Yıkama

Giriş vanasını, dönüş vanasını ve geçiş vanasını kapatın ve dönüş ucunu ve geçiş borusunu atık sıvı tankına yerleştirin. Giriş tankını enjeksiyon için 1 L su ile doldurun.

Giriş ve dönüş vanalarını açın, geçiş vanalarını kapatın, pompayı açın, dönüş hattını %10 hacimde saf su veya enjeksiyonluk su ile temizleyin ve giriş basıncını 0,35 bar'da (5 psi) koruyun.

Filtre vanasını açın, dönüş vanasını kapatın ve TMP'yi 0,35bar'da tutarak filtre borusunu temizlemek için kalan enjeksiyon suyunu kullanın.

 

2.2.4 Dezenfeksiyon

Giriş vanasını, geri dönüş vanasını ve iletim vanasını kapatın ve dönüş ucu ile iletim uç hatlarını atık sıvı tankına yerleştirin. Giriş tankını 2L temizleme solüsyonuyla doldurun.

Giriş ve dönüş vanalarını açın, geçiş vanalarını kapatın, pompayı açın, dönüş hattını 200mL 0,5M sodyum hidroksit ile temizleyin ve giriş basıncını 0,35bar'da (5psi) koruyun .

Geçiş valfini açın, dönüş valfini kapatın ve geçiş borusunu 200mL hacimli temizleme solüsyonuyla temizleyin, TMP'yi 0,35 bar'da tutun.

Daha sonra dönüş ucu ve geçiş borusu, döngüsel temizlik için sıvı tankına yerleştirilir. 30 dakika boyunca proses teğetsel akış hızının 1 ~ 1,5 katı ile temizleme döngüsü.

0.5M sodyum hidroksiti boşaltın ve nötr hale gelinceye kadar 2.2.4'e göre enjeksiyonluk su ile durulayın.

 

2.2.5 Su akışı testi

Giriş tankına arıtılmış su ekleyin, giriş tankındaki su sıcaklığını ölçün ve kaydedin. Dönüş ucunu tanka yerleştirin. Pompayı çalıştırın ve 0,35bar (5psi) transmembran basınç farkı elde etmek için pompa hızını ve dönüş valfini ayarlayın. Bir silindir kullanarak, geçiş ucundaki akış hızını mL/dak cinsinden ölçün ve kaydedin. 1bar (15psi) transmembran diferansiyel basıncı elde etmek için pompa hızını ve dönüş valfini ayarlayın. Bir silindir kullanarak, geçiş ucundaki akış hızını mL/dak cinsinden ölçün ve kaydedin.

Su akış değerini standartlaştırmak için hesaplanan su akış değerini transmembran basınç farkına bölün ve aşağıdaki tabloda sıcaklık düzeltme faktörünü çarpın.

 

2.2.6 Ultrafiltrasyon konsantrasyonu

Tampon üst kısmıyla sistemdeki suyu yıkayın. Sistemin pH'ını ve iyon stabilitesini ayarlamak için 5 dakika döngü yapın. Sıcaklığın ayarlanması gerekiyorsa sistem sıcaklığı stabil hale gelinceye kadar döngüye devam edin.

Besleme sıvısını giriş tankına ekleyin, bir besleme akış hızı (örn. 400LMH) ayarlayın ve baştan sona akış hızını farklı TMP değerlerinde test edin. Test verilerine göre apsis olarak TMP ve ordinat olarak Flux ile eğriler çizildi.

Geçiş borusunu, geçiş ucu toplama tankları, atık sıvı tankları ve proses drenajları gibi uygun bir konteynere veya drenaja yönlendirin.

Besleme tankındaki besleme sıvısının başlangıç ​​ağırlığını kaydedin, besleme pompasını çalıştırın ve besleme sıvısını 3 ila 4 dakika boyunca yavaşça sirküle edin. Devridaim, akış yolunda kalan havanın giderilmesine yardımcı olabilir ve böylece filmin performansını en üst düzeye çıkarabilir.

Geçiş vanasını açın, optimum teğetsel akış hızına ulaşılıncaya kadar pompa hızını yavaşça artırın ve sistemin optimum TMP'sini elde etmek için dönüş vanasını ayarlayın.

Daha sonra tüpü toplama kabına koyun, sıvı kaba girdiğinde zamanlamayı başlatın ve giriş ve dönüş basıncını uygun aralıklarla kaydedin ve anlık basıncı hesaplamak için geri dönüş ucunda ve geçiş ucunda zaman içindeki sıvının kalitesini kaydedin. akış hızı.

Numunenin ultrafiltrasyon konsantrasyonu, beslemenin sıvı hacmi hedef konsantrasyon hacmine azaltıldığında tamamlanır.

 

2.2.7 Diyaliz

Giriş borusunu, doldurma borusunu ve dönüş borusunu emme tankına koyun, iletim borusunu toplama kabına koyun ve toplama kabını temizlemek için terazinin üzerine koyun.

Geri dönüş vanasını açın, giriş pompasını çalıştırın, geçiş vanasını açın, pompa hızını ve TMP'yi uygun değere ayarlayın. İkmal pompasını açın, giriş tankındaki sıvı hacmini değiştirmeden tutun ve eşit hacimli diyalize başlayın. Sıvı kaba girdiğinde zamanlamayı başlatın ve giriş ucundaki basıncı, dönüş ucundaki basıncı ve uygun zaman aralığında sıvının kütlesini kaydedin ve hesaplayarak anlık akış hızını elde edin.

 

2.2.8 CIP

İlk olarak tamponla durulayın, ardından enjeksiyonluk su ile durulayın (çalışma 2.2.3), ardından temizlik maddesiyle temizleyin (çalışma 2.2.4) ve son olarak enjeksiyonluk su ile durulayın (çalışma 2.2.3).

 

2.2.9 Su akışı testi

İşlem şu şekildedir: 2.4.5.

 

2.2.10 Membran kasetinin saklanması

Kısa süreli depolama (3 güne eşit veya daha az), membran kasetini fikstürde tutun ve 10 dakika ila 15 dakika arasında döngü yapmak için depolama çözümünü kullanın, sistem vanasını kapatın, sıvı pompasına giden güç kaynağını kesin ve sıvı giriş tankının doğru şekilde kapatıldığından emin olun.

Depolama süresi 3 gün ila 1 ay arasındaysa, lütfen membran kasetini tertibattan çıkarın ve plastik bir torbaya veya başka bir hava geçirmez kaba koyun. Plastik bir torbaya veya hava geçirmez bir kaba yaklaşık 50 ila 100 mL arası saklama solüsyonu ekleyin ve kapatın. Veya doğrudan depolama çözümüne daldırılabilir. Aşağıdaki tabloda saklama koşulları önerilmektedir.

 

3 Sonuçlar ve analiz

 

3.1 Pirojen giderme verimliliğini etkileyen faktörlerin araştırılması

Ultrafiltrasyon çalışma basıncı: 15 test partisi sürekli olarak gerçekleştirildi. Her partide, filtreleme basıncı, ultrafiltrasyon sırasında 5, 10, 15 ve 2{{10}}psi'de tutuldu ve virüs toplama sıvısı, 30 kez konsantre edildi ve tampon sıvısı ile elüt edildi (hacminin 10 katı) sürekli akışta. Aşağıdaki tabloda gösterilen sonuçlar, endotoksinin uzaklaştırılma oranının %87,0'dan az olduğunu, antijenin geri kazanım oranının %86,0'da stabil olduğunu ve konakçı proteinin uzaklaştırılma oranının %90,0'da stabil olduğunu gösterir. farklı çalışma basınçlarının antijen geri kazanımı, endotoksin uzaklaştırılması ve konakçı protein uzaklaştırılması üzerindeki etkisi üzerinde çok az etkiye sahip olduğu görüldü.

Ultrafiltrasyon konsantrasyon oranı: 15 test partisi sürekli olarak gerçekleştirildi. Her partide virüs toplama sıvısı, ultrafiltrasyon sırasında sırasıyla 30 kez, 50 kez, 80 kez ve 100 kez konsantre edildi. Filtrasyon basıncı 20 psi'de tutuldu ve tampon sıvısı (hacminin 10 katı) sürekli akışla elüt edildi. Sonuçlar, aşağıdaki tabloda gösterildiği gibi, endotoksinin uzaklaştırma oranı %53,3 ila %86,9 arasında değişmiştir, antijen geri kazanım oranı %86,0'da sabit kalmıştır ve konakçı proteinin uzaklaştırılma oranı %91,0 seviyesinde sabit kaldı. Bölümlere ayrılmış örneklemede, iletim çözeltisinde hiçbir antijen tespit edilmedi ve konakçı proteinin %10'undan azı, konsantre virüs çözeltisinde kaldı. Konsantre virüs çözeltisindeki endotoksin konsantrasyonu, konsantrasyon sürelerinin artmasıyla birlikte arttı ve endotoksin giderme oranı, konsantre numunede 80 kat ile en yüksek seviyedeydi ve üretici aynı zamanda 100 kat konsantrasyonu da dikkate alabilirdi; bu sadece üretim verimliliğini artırdı ve maliyeti düşürdü, ancak aynı zamanda aşı üretiminin gereksinimlerini de karşıladı.

 

3.2 Membran kaseti akısının tükenmesi ve temizleme rejenerasyonu

Tedaviden sonra membran akı geri kazanım oranı %92,6 idi. Yeni membran kasetinin ilk geri kazanım oranı, besleme sıvısının mevcut gözlem özelliklerine göre normaldir, ikinci ve NTH zamanlarının müteakip tahmini, membran kaset akı geri kazanım oranı bu işlemden sonraki verilere yakın olacaktır ve istikrarlı olma eğilimindedir. Tek kullanımdan sonraki 2 saat içinde membran kasetinin tükenmesi idealdi ve genel çalışma sırasında membran akışının yalnızca %10'u tükendi.

3.2.1 Membran kaset işleme sürecinde akı tükenmesi

3.2.2 Membran kasetinin temizlenmesi ve yenilenmesinin sonucu

 

Rehberlik Hakkında

 

Guidling Technology, biyofarmasötikler, hücre kültürü, biyomedikalin saflaştırılması ve konsantrasyonu, teşhis ve endüstriyel sıvılara odaklanan ulusal bir yüksek teknoloji kuruluşudur. Biyofarmasötikler, hücre kültürü vb. uygulama senaryolarını tam olarak karşılayan santrifüj filtre cihazlarını, ultrafiltrasyon ve mikrofiltrasyon kasetlerini, virüs filtresini, TFF sistemini, derinlik filtresini, içi boş fiberi vb. başarıyla geliştirdik. Membranlarımız ve membran filtrelerimiz, ön filtreleme, mikrofiltrasyon, ultrafiltrasyon ve nanofiltrasyonun konsantrasyonu, ekstraksiyonu ve ayrılmasında yaygın olarak kullanılmaktadır. Küçük, tek kullanımlık laboratuvar filtrelemesinden, üretim filtreleme sistemlerine, sterilite testlerine, fermantasyona, hücre kültürüne ve daha fazlasına kadar birçok ürün grubumuz, test ve üretim ihtiyaçlarını karşılamaktadır. Guidling Technology sizinle işbirliği yapmayı dört gözle bekliyor!