Kan Ürünlerinin İnaktivasyonu ve Virüslerin Uzaklaştırılması Teknolojisi

Kan ürünleri, sağlıklı insan plazmasından veya özellikle bağışıklık kazanmış insan plazmasından ayrılmış, saflaştırılmış veya Teşhis, tedavi veya pasif immünoprofilaksi için rekombinant DNA teknolojisiyle yapılan". Kan ürünleri tıbbi acil durumlarda, savaş yaralanmalarında kurtarmada ve bazı spesifik hastalıkların önlenmesinde ve tedavisinde önemli bir rol oynar.

 

Düzenleyici arka plan

Güvenlik güvencesi uygulamalarının, nihai ilacın düzenleyiciler ve nihayetinde hastalar ve halk için güvenli olmasını sağlaması gerekir. 1990'larda, Uluslararası Koordinasyon Konferansı (ICH 1998), viral güvenlik için dünya çapında bir standart oluşturan "Q5A: İnsan veya Hayvan Kökenli Hücre Hatlarının Biyoteknolojik ürünlerinin Viral Güvenlik Değerlendirmesi"ni (Q5A: Viral Güvenlik Değerlendirmesi) yayınladı.

ICH Q5A, bu hedefe ulaşmak için doğrulamanın test edilmesi ve onaylanması için çok katmanlı bir şemayı açıklamaktadır. Test programı, ürün risk analiziyle tamamlanan hücre bankası, hammadde ve biyoreaktör hasadına odaklanıyor. ICH Q5A, teste ek olarak, yukarı yönde hiçbir kirletici madde tespit edilmediğinde, aşağı yöndeki dekontaminasyonun arızaya karşı güvenli bir önlem olarak değerlendirilmesini gerektirir. Temizleme doğrulaması, herhangi bir virüsün test rejiminden kaçması durumunda, nihai ilaç ürününde yer almadan önce ortadan kaldırılabilmesini ve/veya etkisiz hale getirilebilmesini sağlar.

 

Genel virüs güvenlik programının arka planı

Modern biyoteknolojik üretimde (veya biyoproseste), saflaştırılmış dizinin tamamında genellikle virüsü ortadan kaldırabilen veya etkisiz hale getirebilen üç veya dört birim operasyon vardır. Buna belirli kromatografik adımlar (protein A veya anyon değişimi gibi), düşük pH'lı kültür veya deterjanlar ve virüs tutma filtreleri dahildir. Bu adımların tümü, tüm virüsleri etkili bir şekilde kaldırmaz veya etkisiz hale getirmez.

Örneğin, düşük pH kültürü genellikle zarfsız virüs inaktivasyonu için etkisizdir, ancak zarflı virüs inaktivasyonu için iyi çalışır. Belirli çalışma koşulları altında, anyon değiştirme kolonu, nötr izoelektrik virüsleri ürün akışından bağlayamayabilir ve çıkaramayabilir, ancak asidik virüslere karşı etkilidir.

Biyoteknoloji ürünlerinin virüs güvenliğini birlikte sağlayan üç ila dört bağımsız ve ortogonal ünite işleminin birleşimidir.

 

Genel olarak sağlam, verimli ve güvenilir bir işleme adımının çok sayıda virüsü (tipik olarak 4 log10 veya daha fazlası olarak tanımlanır; burada log azaltma değeri veya LRV, toplamın log10'u olarak hesaplanır) kaldırabileceği veya etkisiz hale getirebileceği varsayılır. girdideki virüs sayısının çıktıdaki toplam virüs sayısına bölümü). Ancak LRV, bir adımın etkinliğinin tek bir mutlak ölçüsü olarak kullanılamaz. Veriler ön hazırlık olabilir. Modellenmesi kolaydır, proses koşullarındaki değişikliklere nispeten duyarsızdır ve çeşitli virüslere karşı etkilidir (WHO 2004).

Viral filtrasyon, yaygın olarak güçlü ve etkili bir süreç adımı olarak kabul edilmektedir ve biyoteknoloji ürünlerinin üretimi sırasında eksojen ve endojen viral partikül riskini en aza indirmeye yönelik genel stratejinin önemli bir bileşenidir.

Viral filtreler genellikle güçlü, boyuta dayalı tutma mekanizmalarıyla çalışır. Bu güçlü etki mekanizmasına dayanarak, viral filtrelerin bir dizi virüs için öngörülebilir viral alıkoyma sağlama olasılığı kromatografik adımlardan daha fazladır. Bunun nedeni, filtrenin, farklı virüslerin fizikokimyasal özelliklerindeki farklılıklardan ve çalışma koşulları tarafından düzenlenen virüs-reçine etkileşimlerinden etkilenme olasılığının daha düşük olmasıdır. Bu nedenle viral filtrasyon adımı, iyi tasarlanmış rekombinant terapötik protein saflaştırma işlemlerinde (EMEA 1996) yaygın olarak kullanılır ve bunların plazma işleme endüstrisinde de güçlü performansa sahip olduğu gösterilmiştir.

 

Ancak kan ürünleri iki ucu keskin bir kılıç gibidir; binlerce hayat kurtarmakla kalmayıp, hastalıkların yayılmasına ve insan sağlığına tehdit oluşturma olasılığına da sahiptir. İstatistiklere göre, 1977'den 1984'e kadar, Amerika Birleşik Devletleri'nde en az 30000 kan alıcısına AIDS virüsü bulaşmış kan verildi. 1985 yılında Fransa'daki her 3000 hemofili hastasından 1.200'üne kan nakli veya kan ürünleri yoluyla AIDS bulaşmıştı.

Dünya Sağlık Örgütü'ne göre, dünya çapındaki AIDS enfeksiyonlarının %5 ila %10'u, AIDS ile enfekte kan veya kan ürünlerinin transfüzyonundan kaynaklanmaktadır. Çin'deki ilk AIDS vakası, AIDS virüsü taşıyan ithal kan ürünlerinin kullanılmasıyla bulaştı. Ayrıca kan ve kan ürünleri transfüzyonu nedeniyle hepatit B ve C hastalıklarının bulaştığı da rapor edilmiştir.

 

1. Kan ürünleriyle bulaşan başlıca virüsler ve özellikleri

Tablo 1'de görüldüğü gibi kan ve kan ürünleri yoluyla bulaşan birçok virüs türü bulunmaktadır. Bunlar arasında HIV, HBV ve HCV, yüksek enfeksiyon oranları ve ciddi zararları nedeniyle yerli ve yabancı tıp çevrelerinin ilgisini çekmektedir.

Kan ve kan ürünlerinin virüs yayma olasılığı bulunması nedeniyle hastalıkların önlenmesi ve tedavisinde uygulanmasını ciddi şekilde etkilemiştir. Bu nedenle kan ürünlerinin üretiminde kan ürünlerinin güvenliğinin sağlanması için virüs inaktivasyon ve uzaklaştırma işlemlerinin de eklenmesi gerekmektedir.

2. Virüsün etkisiz hale getirilmesi ve uzaklaştırılmasının ana yöntemleri

Kan ürünlerinin güvenliğini sağlamak amacıyla, kan bağışçılarının seçimi, mümkün olduğu durumlarda aşılama, toplanan kanın sıkı bir şekilde test edilmesi ve diğer önlemlere ek olarak, kan ürünlerine yönelik virüs tedavisinin etkisizleştirilmesi ve kaldırılması, kan bağışçılarının korunmasını sağlamak için önemli bir bağlantıdır. Kan transfüzyonunun güvenliği. Virüsleri etkisiz hale getirmek ve ortadan kaldırmak için yaygın olarak kullanılan çeşitli ve etkili yöntemler aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

 

I. Virüs etkisizleştirme yöntemleri

1. Pasteur yöntemi

Bu yöntemin teorik temeli, sıcaklık ve etki süresinin seçimi yoluyla virüs yapısının tahrip oranının protein yapısına göre çok daha yüksek olmasıdır. Yaklaşık 50 yıllık klinik kullanım sonuçları ve son hayvan deneyleri, 60 derece, 10 saatlik ısıtma işleminden, yani Pasteur dezenfeksiyonundan sonra çözelti halindeki albüminin yalnızca HBV'yi değil, aynı zamanda HCV ve HIV'i de etkisiz hale getirerek albümini en güvenilir hale getirdiğini doğruladı. Viral güvenlikte kan ürünü.

Son zamanlarda Pasteur'ün prosesi IVIG, FVI, FIX, fibrinojen ve diğer ürünlerin üretimini kapsayacak şekilde genişletildi. Bridonnccu ve ark. düşük sıcaklıkta etanol üretimi IVIG sürecine bu virüs inaktivasyon işlemini ekledi, yani stabilizatörün olmadığı, tuzun ve asitliğin düşük olduğu koşullarda Pasteur yöntemi uygulandı ve virüs titresi 5 Log azaldı. Simmonds ve ark. Birleşik Krallık'ta klinik olarak kullanılan FVⅢ ve FIX konsantre preparasyonlarında transfüzyonla bulaşan virüsü (TTV) test etmiş ve Pasteur virüs inaktivasyonu olmayan ürünlerin TTV tespit oranının %50 ila %75 arasında olduğunu ve pozitif tespit oranının pozitif tespit oranı olduğunu bulmuştur. Pasteur inaktivasyonundan sonraki ürünlerin oranı 0'dı.

Birleşik Krallık'ta inaktive edilmemiş pıhtılaşma faktörü ürünleri kullanan 84 hemofili hastasında TTV pozitif oranı %27 iken, virüsle inaktive edilmiş pıhtılaşma faktörü ürünleri kullanan 19 hastadan yalnızca 1'i pozitifti ve %5 pozitif tespit oranı vardı. Bu nedenle virüs inaktivasyon işlemi kan ürünlerinin güvenliğinin arttırılmasında oldukça etkilidir.

 

2. Yüzey aktif maddeyle birleştirilmiş organik çözücü (S/D yöntemi)

This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >%90. S/D yöntemiyle inaktive edilen çok sayıda kan ürününün güvenli ve güvenilir olduğu uzun süreli klinik uygulamalarla kanıtlanmış olduğundan yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak bu yöntemin parvovirus B19, HEV ve diğer lipo kaplı olmayan virüslere karşı inaktivasyon özelliği yoktur.

 

3. Kuru ısıyla inaktivasyon yöntemi

Kuru ısıyla inaktivasyon, liyofilize preparatın ısıtılarak işleme tabi tutulması ve virüsün kuru ısıyla öldürülmesi anlamına gelir. Yaygın olarak kullanılan kuru ısıtma yöntemleri, 60 derece ~80 derece, 10~72 saat ısıtma yöntemi ve 80 derece, 72 saat arıtma yöntemidir. 1980'lerin başlarında, FVIII liyofilize konsantre preparasyonunu ve protrombin kompleksini 60 derece ila 80 derece arasında 10 ila 72 saat süreyle ısıtmak faydalıydı. Ancak bu yöntemin HBV, HCV, HIV'i tamamen etkisiz hale getiremediği kanıtlanmıştır. 80 derece ve 72 saatte uygulanan kuru ısıl işlemin HBV, HCV ve HIV'i etkisiz hale getirmede etkili olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca 100 derecede muamele edilen pıhtılaşma faktörlerinin liyofilize preparasyonlarına ilişkin son raporlar da bulunmaktadır. Xu Jinbo ve arkadaşları, IgG'yi 100 derecede 30 dakika boyunca tedavi ettiler ve veziküler stomatit virüsü 8.2 Log'u etkisiz hale getirdiler. Bazı insanlar kurutulmuş FVIII'i 72 saat boyunca 68 derecede, kuru halde dondurur ve daha sonra 0,5~1 saat boyunca 100 derecede ısıtır. Bu yöntem nispeten ekonomiktir.

 

4. Fotokimyasal yöntem

This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6.6 HIV'e bağlanan hücrelerin kaydı ve trombositler, FDA tarafından klinik denemeler için onaylanan, in vitro 7 günlük fonksiyonel korumanın ardından iyi durumda kaldı.

Bu yöntemlerden Pasteur dezenfeksiyon yöntemi ve S/D yöntemi Amerika Birleşik Devletleri FDA tarafından onaylanmıştır ve dünyada yaygın olarak kullanılmaktadır. Kuru ısıyla inaktivasyon yöntemi esas olarak liyofilize preparatların virüs inaktivasyonu için uygundur. Fotokimyasal yöntem, lipid kaplı virüsler üzerinde güçlü bir inaktivasyon etkisine sahiptir ve Avrupa'da tam plazma virüsü inaktivasyonunda kullanılmaktadır ve kan hücresi bileşenlerinde virüsün inaktivasyonu için geniş umutlara sahiptir. Ancak tüm bu yöntemlerin kendi eksiklikleri vardır; örneğin Pasteur sterilizasyonu bazı ısıya dayanıklı virüslerin etkisizleştirilmesi için ideal değildir; S/D yöntemi, lipo kaplı olmayan virüsü etkili bir şekilde etkisiz hale getiremedi. Fotokimyasal yöntem bazı plazma proteinlerinin aktivitesine önemli ölçüde zarar verdi. Takip araştırmalarının mevcut klinik kullanımı, hiçbir virüs inaktivasyon yönteminin, kan ürünlerinin virüs bulaşma riskinden tamamen arınmış olduğunu garanti edemeyeceğini göstermektedir.

 

I. Virüs temizleme işlemi

Kan ürünlerinin üretiminde tek bir inaktivasyon işlemi tüm virüsleri etkisiz hale getiremez; Ek olarak, virüsün kendisi de heterolog bir protein olduğundan, ürünle birlikte girilmesi olumsuz reaksiyonlara neden olacaktır; Aynı zamanda teknik seviye sınırlaması nedeniyle hala özellikleri bulunamayan veya anlaşılamayan virüsler mevcut olduğundan mevcut virüs inaktivasyon yöntemleri bu virüslerin inaktivasyon etkisini garanti edememektedir. Bu nedenle, etkisizleştirme tek başına ürünün güvenliğini garanti edemez ve üründen uzaklaştırılması gerekir. Dolayısıyla virüs temizleme teknolojisi giderek daha fazla ilgi görüyor. Yaygın olarak kullanılan ve etkili iki virüs temizleme işlemi aşağıda kısaca anlatılmıştır.

1. Kromatografik teknoloji

Kromatografik teknoloji, çeşitli bileşenlerin ayrılmasını sağlamak için çeşitli bileşenlerin ve sabit faz afinitesinin veya etkileşim farklılıklarının kullanılmasını ifade eder. Kan ürünlerinin üretimi için ileri bir teknoloji olan kromatografinin kendisi, özellikle afinite kromatografisi ve iyon değişim kromatografisi olmak üzere virüsleri ortadan kaldırma etkisine sahiptir. İyon değiştirme kromatografisi için elüsyonun, virüsün uzaklaştırılmasında penetrasyona göre avantajları vardır. Tablo 2, Avustralya'daki CSL Şirketi tarafından albümin üretimi sürecinde kromatografik teknoloji ile HAV uzaklaştırma oranının veri istatistiklerini göstermektedir. Tablo 2'den görülebileceği gibi iyon değiştirme kromatografisi ve jel filtrasyonu, toplam 10,9 Log çıkarma oranıyla HAV'un giderilmesinde daha etkilidir.

Baxter Healtheare, FVIII üretiminde, (4,2±0,1)Log ve (5,3±0,9)Log'u olmayanlardan kaldırabilen, anti-FVIII antikoru ile işlenmiş jeller kullanarak immün afinite kromatografisi gerçekleştirir. -sırasıyla PPV ve HAV gibi lipit kaplı virüsler.

 

2. Nanofilm filtrasyonu

HAV ve parvovirüs B19 gibi yüzey çapı küçük olan bazı virüsler için nanomembran filtrasyonu en etkili uzaklaştırma yöntemidir. Virüsleri izole etmek için proteinler ve virüsler arasındaki boyut farkından ve virüslerin filtre membranı tarafından adsorbe edilmesinden yararlanır. Hollanda'daki Sanquin Kan Tedarik Tesisinde, protrombin kompleksi üretim sürecine tek adımlı, iki aşamalı Planova 15N nanomembran filtrasyonu eklenerek virüslerin uzaklaştırılmasına yönelik bir laboratuvar çalışması gerçekleştirildi. Nanomembran filtrasyonundan sonra HIV, HAV ve diğer virüslerin uzaklaştırılma oranlarının değişen derecelerde arttığı bulunmuştur (bkz. Tablo 3).

Ancak bu yöntem endüstriyel üretime uygulandığında aşağıdaki sorunlar ortaya çıkabilir: Öncelikle ürünün viskozitesinin yüksek olması ve büyük çaplı proteinlerin bulunması nedeniyle, filtre tarafından seçilen membranın gözenek boyutu çok küçük olmamalıdır, böylece HCV gibi küçük çaplı virüslerin uzaklaştırılması sınırlanır; İkinci olarak, filtre üretimi sürecinde membran gözenek boyutu kontrolünün stabilitesi virüsün uzaklaştırılmasını etkileyecektir. Üçüncüsü, virüs partikülünün çapından daha küçük olan membran açıklığı bloke edildiğinde ürün akış hızı düşecek ve bu da verimi etkileyecektir. Bu nedenle özellikleri ve gözenek boyutları işlenmiş ürünlerin ihtiyaçlarına uygun membranların seçimi, nanomembran filtrasyonunun virüsleri giderip uzaklaştıramayacağı konusunda önemli bir faktördür.

 

3. Tartışma

Kan kaynağının kalitesinin sağlanması öncülüğünde, virüsün etkisiz hale getirilmesi ve uzaklaştırılması süreci, kan ürünlerinin güvenliğini sağlamak için önemli ve gerekli bir araçtır. Yalnızca bir adet etkisiz hale getirilmiş virüs işleminin kullanılması, kan ürünlerinin güvenliğini kesinlikle garanti edemez. Virüs inaktivasyon teknolojisi temelinde, kromatografi ve nanofilm filtrasyonu gibi virüs giderme teknolojisi eklendi, virüs giderme oranı büyük ölçüde artırıldı ve virüs etkisizleştirme ve giderme etkisi önemli ölçüde iyileştirildi. Şu anda Avrupa, kan ürünlerinin üretim sürecinde, kan ürünlerinin güvenliğini sağlamak için virüslerin en az bir inaktivasyonu ve uzaklaştırılmasının kullanılması gerektiğini açıkça önermektedir.

Çin'de çoğu kan ürünü üreticisi, üretim sürecinde Pasteur dezenfeksiyon yöntemi, S/D yöntemi vb. gibi yalnızca tek bir inaktif virüs sürecini kullanıyor ancak kan ürünlerinin kalitesini ciddi şekilde etkileyen virüs temizleme işlemini kullanmıyor. Çin'in DTÖ'ye katılımıyla yerli kan ürünlerinin üretim süreci ve kalite standartları dünya ile aynı seviyeye gelecektir, aksi takdirde mevcut iç pazar payını garanti edemediği gibi, dünyadaki diğer ülkelerdeki benzer ürünlerle de rekabet edemeyecektir. uluslararası pazar.

Bu nedenle, Çin'in kan ürünleri üreticilerinin, ürünün kalitesini ve güvenliğini tam olarak sağlamak için üretim sürecini iyileştirmesi, virüsün etkisizleştirilmesini ve ortadan kaldırılmasını güçlendirmesi gerekiyor. Bu nedenle, Çinli kan ürünü üreticilerinin, kan ürünlerinin güvenliğini sağlamak amacıyla kan ürünlerini saflaştırmak ve virüsleri uzaklaştırmak için kromatografiyi kullanmaları bir trend olacaktır.

 

Rehberlik Hakkında

 

Guidling Technology, biyofarmasötikler, hücre kültürü, biyomedikalin saflaştırılması ve konsantrasyonu, teşhis ve endüstriyel sıvılara odaklanan ulusal bir yüksek teknoloji kuruluşudur. Biyofarmasötikler, hücre kültürü vb. uygulama senaryolarını tam olarak karşılayan santrifüj filtre cihazlarını, ultrafiltrasyon ve mikrofiltrasyon kasetlerini, virüs filtresini, TFF sistemini, derinlik filtresini, içi boş fiberi vb. başarıyla geliştirdik. Membranlarımız ve membran filtrelerimiz, ön filtreleme, mikrofiltrasyon, ultrafiltrasyon ve nanofiltrasyonun konsantrasyonu, ekstraksiyonu ve ayrılmasında yaygın olarak kullanılmaktadır. Küçük, tek kullanımlık laboratuvar filtrelemesinden, üretim filtreleme sistemlerine, sterilite testlerine, fermantasyona, hücre kültürüne ve daha fazlasına kadar birçok ürün grubumuz, test ve üretim ihtiyaçlarını karşılamaktadır. Guidling Technology sizinle işbirliği yapmayı dört gözle bekliyor!