Şap Hastalığı Aşısının Üretim Sürecinde Derin Filtrasyon Uygulaması Üzerine Çalışma
Önsöz - Şap Hastalığı Nedir
14. yüzyılda Avrupa'da da benzer şap hastalığının yazılı kayıtları bulunmaktadır. Şap hastalığı, şap hastalığı virüsünün neden olduğu akut, ateşli, oldukça bulaşıcı bir hastalıktır.
Yetişkin hayvanların klinik semptomları şunları içerir: vücut ısısında artış, ağızda kabarcık ve ülserasyon, toynakta kabarcık ve ülserasyon ve hatta tırnak kabuğunun dökülmesi, ekonomik hayvanlarda yeme ve uykuda zorluklara, kilo kaybına ve hatta ekonomik değer kaybına neden olur. ;
Genç hayvanların klinik semptomları şunları içerir: yüksek vücut ısısı, miyokardit ve diğer semptomlar, bir kez başladıktan sonra genç hayvanlarda ölüm oranı yüksektir.
Soyut
Geçtiğimiz 500 yıl boyunca şap hastalığı dünya çapında defalarca ortaya çıktı ve çok sayıda domuz, sığır, koyun ve diğer evcil hayvanlar ile yabani çift parmaklı toynaklılar öldü veya hastalandı, bu da besi hayvanlarını ciddi şekilde etkiledi. ve yetiştirme endüstrisi.
Şap hastalığı aşısının üretim sürecinde derin filtreleme teknolojisinin uygulanmasını incelemek amacıyla, yüzey filtreleme ve derin filtrelemenin filtrelenebilirlik performansı ve ayrıca bakterisidal filtreleme üzerindeki koruyucu etki test edildi ve karşılaştırıldı. Hücre kalıntılarının uzaklaştırılmasında yüksek şarjlı derin filtrelemenin avantajları araştırıldı. Farklı bulanıklığa sahip hücre kültürü ortamı için karşılık gelen filtrasyon şemaları analiz edildi.
Sonuçlar, derin filtrasyon yükünün yüzey filtrasyonunun 13,9 katı olduğunu, filtre sıvısının bulanıklığının yüzey filtrasyonunun yalnızca %23,5'i olduğunu ve ardından gelen 0.2um bakteri giderme yükünün yüzey filtrasyonununkinin 7,2 katı olduğunu gösterdi. yüzey filtreleme. Özel reçine ligandı kullanıldığında, filtre sıvısının bulanıklığı aynı gözenek boyutuna sahip sıradan derin filtrenin bulanıklığının %38,6'sı olur ve bu da aşağı akış prosesinin korunması açısından faydalıdır. Sonuçlar, derin filtrasyonun, özellikle güçlü pozitif yüklü derin filtrasyonun Şap aşısı üretiminde etkili bir şekilde uygulanabileceğini ve farklı kültür ortamları için uygun filtrasyon işlemlerinin oluşturulması gerektiğini gösterdi.
Şap hastalığı ve derin filtreleme
Şap hastalığı (FMD), Şap hastalığı virüsünün (FMDV) neden olduğu çift tırnaklı hayvanlarda görülen akut, ateşli ve bulaşıcı bir hastalıktır. Bu hastalığa en duyarlı hayvanlar sığır, domuz ve koyundur. Şap hastalığı Asya, Afrika, Orta Doğu ve Güney Amerika'da endemik olup, görülme sıklığı ve hızlı bulaşması oldukça yüksektir. Dünya Hayvan Sağlığı Örgütü (OIE), şap hastalığını birinci kategori A zoonotik hastalık olarak listeliyor ve üye devletlerin şap hastalığını ihbarı zorunlu hayvan hastalıkları listesine dahil etmelerini zorunlu kılıyor. Aşılama, Şap hastalığının spesifik olarak önlenmesinin etkili bir yoludur. Sağlam virüsün inaktivatör ile etkisiz hale getirilmesiyle yapılan Şap İnaktive Aşısı, Şap hastalığının önlenmesinde ve kontrolünde önemli rol oynamaktadır.
FMDV'nin antijenitesi zayıftır ve virüsün etkisizleştirilmesinin antijeni üzerinde büyük etkisi vardır. Bu nedenle mevcut Şap aşısı üretiminde yüksek saflıkta Şap aşısı, birim dozun antijen içeriğini ve saflığını sağlayabilir; bu özellikle önemlidir ve aynı zamanda mevcut aşılama stratejisidir. Bu, virüslerin aşağı yönde saflaştırılması için yüksek gereksinimleri ortaya koymaktadır. Ek olarak, 2009'dan önce, Çin'deki etkisizleştirilmiş şap hastalığı aşılarının yukarı akışı çoğunlukla şişeyi döndürme ve duvara yapıştırma kültür yöntemini benimsemişti. Aşılara olan talebin artmasıyla birlikte, çok sayıda döner şişe gerektiren bu kültür yönteminin, düşük verim ve düşük ekspresyon düzeyi gibi dezavantajları giderek ortaya çıktı.
Bu nedenle son yıllarda hücre kültürü teknolojisi yavaş yavaş önceki yapışık kültürden süspansiyon kültürüne dönüştü ve virüs üretimi önemli ölçüde iyileştirildi. Bununla birlikte, virüs üretiminin artmasıyla birlikte kültür modunun değişmesi, aşağı saflaştırma işlemine daha fazla baskı getirdi çünkü kültür işlemi tarafından üretilen hücre döküntüsü, konakçı proteinlerin hücre salınımı, konakçı DNA vb. buna uygun olarak arttı ve bu da aşağı yöndeki saflaştırma kabiliyetine ilave gereksinimler getirmektedir.
Membran filtrasyon teknolojisi, aşılar gibi biyolojik ürünlerin üretim sürecinde yaygın olarak kullanılmaktadır; bunların arasında DC filtrasyon teknolojisi genellikle hücre döküntüsü gibi çözünmeyen yabancı maddeleri ayırmak için hastalık zehirinin hasat sürecinde kullanılır. Erken FMDV açıklamasında, esas olarak katlanır membran filtre elemanı tarafından temsil edilen yüzey filtreleme teknolojisi benimsenmiştir. Kültür koşullarının değişmesi, hücre artıklarının safsızlıklarının artması, yüzey filtrasyonunun berraklaştırma etkisini elde etmesi zordur ve yüzey filtrasyon yükü düşük olduğundan, filtre malzemelerinin maliyeti giderek artmaktadır.
Yukarıdaki bilgiler ışığında, FMDV'nin sitolikit ayrımı sürecinde derin filtrasyon giderek daha fazla uygulanmaktadır. Derin filtre malzemesi genellikle doğal kaynaklardan elde edilen uzun ve ince liflerden oluşur ve filtre ortamının bir film oluşturduktan sonra oluşturduğu kanal, labirent açıklık yapısına benzer şekilde genellikle çok kıvrımlıdır. Safsızlık parçacıkları genellikle yüzey yerine filtrenin içinde tutulur. Ayrıca, filtre kanalının duvarı genellikle elektrostatik etki veya moleküller arası kuvvet yoluyla son derece ince parçacık yabancı maddelerin bir kısmını emer. Genel olarak, derin filtrasyonun filtrasyon mekanizması, mekanik tutma ve adsorpsiyon ile karakterize edilir.
Sabit akım filtreleme yöntemi
Derin filtre plakasını sabit akım filtre cihazına takın, filtre plakasını 54 L/m2'nin üzerinde tampon PBS ile yıkayın; Yıkama bittikten sonra, sıvıyı yavaşça pompalamak için peristaltik pompayı çalıştırın, pompa hızını yavaşça beklenen akış hızına ayarlayın ve sıvıyı filtreleyin. Filtrasyon işlemi sırasında filtrasyon hacmini, süresini, basınç farkını ve bulanıklığı kaydedin. Süzüntü antijen tespiti için toplandı.
Derin filtrelemenin avantajları
Yüzey filtrasyonu, filtrelemeyi sağlamak için filtre malzemesinin yüzeyindeki parçacıkları yakalayan bir teknolojidir. Filtrasyon mekanizması esas olarak akışkan eleğindeki parçacıkların boyutuna dayanır; büyük parçacıklar filtre membranının yüzeyinde tutulur. Derin filtreleme, parçacıkların yakalanması ve derinlikte adsorpsiyon için dahili kanalları kullanır. İkisinin karşılaştırma diyagramı Şekil 1'de gösterilmektedir.
Belirli bir üreticinin şap hastalığı aşısının etkisiz hale getirilmiş çözeltisi, sırasıyla 0.45um polipropilen yüzey membranı ve derin filtre plakası ile önceden filtrelendi ve ardından 0.2um bakteri öldürücü filtre ile filtrelendi. Filtrelenebilirlik verileri Tablo 1'de gösterilmektedir.
Şap aşısı inaktif solüsyonunun bulanıklığı 77 NTU'dur. Bakteriler doğrudan filtrelenirse, çok sayıda hücre parçası kaçınılmaz olarak 0.2um filtre membranının hızla tıkanmasına neden olacak ve bu da 146S vipartiküllerinin iletimini etkileyecektir. Bu nedenle ön filtreleme, bakteri giderme filtrelemesinden önce tasarlandı ve iki ön filtreleme yöntemi olan derin filtreleme ve yüzey filtreleme karşılaştırıldı. Filtrasyon için çift katmanlı derin filtre plakası seçilir, yük 641 L/m2'dir ve derin filtre, 77 NTU'luk malzemeyi berrak ve parlak olan 9,65 NTU'ya düşürür. 0.45um'luk yüzey filtreleme yükü yalnızca 46 L/m2'dir ve filtre sıvısının bulanıklığı 41 NTU kadar yüksektir, bu da ön filtreleme için uygun değildir. Sonraki 0.2um bakteriden arındırılmış filtrasyon yükünün karşılaştırmasına göre, derin filtrasyondan sonra bakteriden arındırılmış filtrasyon membran yükü 655 L/m2'dir; bu, karşılık gelen yüzey filtrasyonu filtrasyon yükünün 7,2 katıdır (yalnızca 91 L/m2) .
146S test sonuçları, derin filtrasyon sisteminin veriminin, yüzey filtrasyon sistemine göre daha yüksek olduğunu göstermektedir. Derin filtrasyon yükü, yüzey filtrelemenin 13,9 katıydı, filtre sıvısının bulanıklığı, yüzey filtrelemenin yalnızca %23,5'iydi ve ardından gelen 0.2um bakterileri gideren filtrasyon yükü, filtre sıvısının bulanıklığı, yüzey filtrelemeninkinden 7,2 kat daha fazlaydı. yüzey filtreleme. Bu nedenle hem maliyet açısından hem de verim açısından derin filtrasyon sistemi, yüzey membranlı filtrasyon sistemine göre önemli ölçüde daha iyidir.
Güçlü pozitif yüklü derin filtrenin avantajları
Pozitif yüklü derin filtre plakası ve güçlü pozitif yüklü derin filtre plakası, farklı kaynaklardan elde edilen şap hastalığı aşısının etkisizleştirilmiş solüsyonunu karşılaştırmak için kullanıldı. Filtrelenebilirlik sonuçları Tablo 2'de gösterilmektedir ve filtreleme işlemindeki filtreleme hızı ve basınç farkının değişimi renk düzeninde 2 gösterilmektedir.
Kullanılan iki derin filtre plakası grubu aynı açıklık doğruluğuna sahiptir ve yük ve basınç farkı değişimi açısından performans oldukça tutarlıdır ve Şekil 2'deki basınç farkı değişim eğrisi temel olarak aynıdır.
Ancak filtre sıvısının bulanıklığından dolayı fark çok büyüktür. Sıradan pozitif yüklü çift katmanlı filtre plakasının filtre sıvısı 25 NTU'dur, aynı açıklığa sahip güçlü pozitif yüklü derin katmanlı filtre plakasının filtre sıvısı ise yalnızca 9,65 NTU'dur, bu da sıradan derin filtre plakasının yalnızca %38,6'sıdır. Bunun temel nedeni güçlü pozitif yüklü derin filtre plakası filtre malzemesindeki özel reçine ligandıdır. Güçlü pozitif çift katmanlı filtre plakası ile bulanıklık 10NTU'nun altına düşürülür ve hücre parçaları tamamen adsorbe edilir veya tutulur, bu da sonraki ultrafiltrasyon veya bakterisidal filtrasyon işlemine yardımcı olur. Çözünmeyen hücre kalıntıları üzerindeki adsorpsiyon etkisine ek olarak, Yigzaw Y ve arkadaşları ayrıca güçlü pozitif yüklü derin filtre plakasının hücre konakçı proteini üzerindeki uzaklaştırma etkisini de bildirmiştir ve Dorsey N ve arkadaşları, güçlü pozitif yüklü derin filtre plakasının uzaklaştırma etkisini bildirmiştir. DNA'da.
Şap hastalığı aşısının süpernatantı için derin filtrasyon yoluyla berraklaştırma filtrasyon prosesinin oluşturulması
Yukarıdaki karşılaştırmalı yüzey filtrasyonu ve derin filtrasyon çalışması ve özel güçlü pozitif yüklü derin filtre plakasının temizleme etkisinin incelenmesi yoluyla, farklı filtreleme şemaları, farklı koşullar altında üretilen şap hastalığı aşısının etkisizleştirilmiş süpernatanıyla eşleştirilmelidir. kültür koşulları. 3 farklı bulanıklık, düşük bulanıklık, orta bulanıklık ve yüksek bulanıklığa sahip santrifüj süpernatantı için derin filtrasyon şeması ve karşılık gelen filtrasyon parametreleri Tablo 3'te gösterilmektedir.
Düşük bulanıklığa sahip santrifüjlü süpernatan için, tek katmanlı derin filtre plakası, az miktarda hücre döküntüsünü etkili bir şekilde temizleyebilir ve kaldırabilir. Orta bulanıklıktaki santrifüj süpernatantı için, çift katmanlı derin filtre plakası etkili bir şekilde netleştirebilir, özellikle güçlü pozitif yüklü derin filtre plakası bulanıklığı 5 NTU'nun altına düşürebilir; Daha yüksek bulanıklığa sahip santrifüjlü süpernatan için kombine filtre plakası etkili bir şekilde arıtılabilir. Hangi proses olursa olsun işleme kapasitesi 500 ~800 L/m2'dir, filtre sıvısının bulanıklığı 20 NTU'dan azdır ve hedef antijen tamamen geri kazanılarak büyük ölçekli üretime uygundur.
Tartışma
1970'lerde, asbest malzemelerindeki kanserojenlerin varlığı nedeniyle filtre ortamının asbest malzemeleri kullanmayacağı belirtildi. Derin filtre malzemesi asbest içermez ve daha güçlü bir pozitif yüke sahiptir. Filtre malzemesi ahşap elyaf matrisinden ve filtre yardımcısından yapılmıştır. Üretim sürecinde, temel bileşenleri bağlamak için polimer reçine kullanılır ve içindeki pozitif yük fonksiyonel grupları, derin filtre malzemesinin yük adsorpsiyon yeteneğini etkili bir şekilde verir. İnce parçacıkları yakalama yeteneği üzerindeki adsorptif derin filtrasyonun mükemmel performansı Şekil 3'te gösterilmektedir.
Bu deneyde, FMDV kültür çözeltisinin filtrasyon testini netleştirmek için farklı reçine bileşenleri ve farklı hassas derin filtre malzemeleri seçildi ve karşılaştırma testi, yüzey filtrasyonu ile gerçekleştirildi. Sonuçlar, derin filtrelemenin hücre artıklarının uzaklaştırılması için yüzey filtrelemeye göre daha uygun olduğunu gösterdi; bu da sonraki mikrobiyal yük kontrol filtreleme ünitesine (0.2um) yardımcı oldu. Ek olarak, güçlü pozitif yük derin filtre plakasının ve sıradan pozitif yük derin filtre plakasının filtreleme etkisini karşılaştırarak, güçlü pozitif yük filtre plakası, bulanıklığı 5 NTU'nun altına düşürebilen güçlü bir bulanıklık kontrol yeteneği gösterir. tüm filtreleme işleminin sağlamlığının arttırılmasına çok yardımcı olur.
Yukarı yöndeki kültür prosesinin, aktif bileşenlerin hasat aşamaları üzerinde büyük etkisi vardır. Testler yoluyla, bu deney sonunda, büyük ölçekli üretim için belirli bir yol gösterici öneme sahip olan, farklı bulanıklığa sahip hücre kültürü ortamı için ölçeklenebilir bir filtreleme şeması oluşturdu.
Guidling Technology tarafından piyasaya sürülecek olan derinlik filtresi, filtre malzemesi olarak derin filtre kartonuna sahip bir tür verimli filtre elemanı olan, biyofarmasötiğin düzenleyici gerekliliklerini tam olarak karşılayan, esas olarak özellikle çıkarılması için tasarlanmış ve üretilmiş, disk tipi bir filtre elemanıdır. hücreler ve hücre parçaları gibi büyük katı içerikleri vardır ve memeli hücre kültürü sıvısına uygulanabilir; Bakteri ve maya hücrelerinin lizatının arıtılması; Konakçı hücre proteininin (HCP) çıkarılması; Virüsü ve DN'yi kaldırın; Endotoksinlerin uzaklaştırılması; Köpük gidericinin çıkarılması.
Ürün, küçük ölü hacim, doğrusal amplifikasyon, disk kapsül yapısı, kompakt yapı tasarımı gibi avantajlara sahiptir ve diğer ekipmanlarla seri olarak kullanılabilir, az yer kaplar, kararlı akış hızı, uzun ömür ve düşük maliyet.
