Rekombinant Escherichia Coli'nin Yüksek Yoğunluklu Fermantasyon Lizatının Berraklaştırma Süreci Üzerine Çalışma

 

Malzeme sıvısının kromatografiye müdahalesini azaltmak ve hedef proteinin geri kazanımını iyileştirmek için, iki rekombinant Escherichia coli suşunun yüksek yoğunluklu fermantasyon lizatının berraklaştırma işlemi incelendi. Streptococcus suis ve Haemophilus parasuis'in anahtar genlerini ifade eden BL{0}}HP1036 ve BL{2}}palA suşları seçildi. Protein verimini bulanıklık ve elektroforez tespiti ile değerlendirmek için teğetsel akış işlemi, yüksek hızlı santrifüjleme işlemi ve membran kaset berraklaştırma işlemi kullanıldı.

 

Sonuçlar, Streptococcus suis ve Haemophilus parasuis'in anahtar genlerini ifade eden BL{0}}HP1036, BL{2}}palA yüksek yoğunluklu fermantasyon lizatının membran kaset filtrasyonu ve santrifüjleme ile berraklaştırıldığını ve protein veriminin %80'in üzerinde olduğunu, bunun kromatografik müdahaleyi etkili bir şekilde azaltabileceğini ve geri kazanım oranını iyileştirebileceğini göstermiştir.

 

giriiş

Şu anda, Streptococcus suis (SS) ve Haemophilus parasuis (HPS), domuz çiftliklerindeki en yaygın bakteriyel hastalık patojenleridir ve domuz endüstrisine büyük kayıplar getirir. SS, toplam 35 serotipe 1-34 ve 1/2 ayrılabilir ve HPS, 1-15 serotipe ayrılabilir ve ikisi genellikle karıştırılır, esas olarak domuz poliseroziti, artrit, menenjit, endokardit, bakteriyel septisemi ve bronşite neden olur.

 

Streptococcus suis ve Haemophilus parasuis'in çok sayıda serotipinin bulunması nedeniyle farklı serotipler arasındaki çapraz koruma zayıftır ve antibiyotiklerle tedavi edildiğinde antibiyotik direnci önemli ölçüde artacak ve bu durum tedavi edici etkiyi etkileyecektir.

 

Aşılar, SS ve HPS'yi önlemenin etkili yollarından biri haline gelmiştir. İnaktif aşılar, zayıflatılmış aşılar, canlı aşılar, alt birim aşılar ve genetiği değiştirilmiş aşılar vardır, ancak inaktif aşılar ve zayıflatılmış aşılar çoğunlukla piyasadadır ve bağışıklık korumaları iyidir, ancak çapraz koruma belirgin değildir. Alt birim aşı, güçlü çapraz korumaya ve düşük fiyata sahip yeni bir aşı türü olan streptococcus suis'e karşı yeni bir aşı türüdür. Streptococcus suis ve Haemophilus parasuis'in alt birim aşılarının araştırılması ve geliştirilmesi, Çin'deki domuz endüstrisini rahatsız eden Streptococcus suis ve Haemophilus parasuis'in önlenmesi ve kontrol sorunlarına mükemmel bir çözüm sunmaktadır.

 

Streptococcus suis ve Haemophilus parasuis alt birim aşıları, rekombinant Escherichia coli tarafından yüksek yoğunluklu fermantasyona tabi tutulur. Lizatın berraklaştırılması, hedef proteinlerin verimi üzerinde büyük bir etkiye sahiptir, ancak konuyla ilgili birkaç rapor vardır. Fermantasyon ve saflaştırma sürecinin berraklaştırma adımının nasıl gerçekleştirileceği önemli bir çalışmadır. Bu makalede, rekombinant E. coli BL21-HP1036, BL21-palA yüksek yoğunluklu fermantasyon nesnesi olarak, berraklaştırıcı çözeltinin bulanıklığını etkili bir şekilde nasıl azaltacağını, protein verimini nasıl iyileştireceğini, Streptococcus suis alt birim aşısı fermantasyon süreci için endüstriyel kırma ve berraklaştırma teknolojisini teorik temel ve teknik destek sağlamak için nasıl iyileştireceğini incelemektir.

 

1. Malzemeler ve yöntemler

1.1 Malzemeler

 

1.1.1 Suşlar

Streptococcus suis ve Haemophilus parasuis BL21-HP1036, BL21-pa-lA suşları

 

1.1.2 Ana ortam ve reaktifler

Maya özütü ve yunus balığı; Sodyum klorür; Kanamisin, IPTG; Formaldehit; SDS-PAGE jel kiti.

 

1.1.3 Ana test ekipmanı

Yüksek yoğunluklu fermentör; Yüksek hızlı santrifüj; Elektroforez cihazı; Ultraviyole jel görüntüleme sistemi; Ultrasonik kırıcı; Küçük yüksek hızlı santrifüj; Ultraviyole spektrofotometre; Sabit sıcaklıklı çalkalama masası; Afinite kromatografisi ekipmanı.

 

1.2 Yöntemler

 

1.2.1 Yüksek yoğunluklu fermantasyon kültürü

Nitelikli rekombinant koliform suşları BL21-HP1036 ve BL21-pa-lA, %2 (V/V)'lik sentetik besiyerine ekildi ve 37 derecede 35-40 saat kültüre edildi.

 

1.2.2 Rekombinant protein kaynaklı ekspresyon

Fermantasyon çözeltisi OD{{0}}±0.1 olduğunda indüksiyon başladı, indüksiyon sıcaklığı 35 derece ±0.5 derece oldu ve kültür 10 saatlik indüksiyonun ardından sonlandırıldı.

 

1.2.3 Yüksek basınçlı homojen kırma ve santrifüjleme

İnaktivasyon testini geçen bakteri sıvısı, hücre çatlatma için sırasıyla 100~150 MPa basınçla yüksek basınçlı bir homojenizatör tarafından ezildi. Ezmeden sonra, ezilmiş sıvı düşük sıcaklıkta tutuldu.

Üstteki sıvı yüksek hızda santrifüj edilerek elde edildi, santrifüj hızı: 15{3}}00 rpm, sıcaklık kontrolü: 10 derece ~15 derece, enjeksiyon hızı: 0,5~1 L/dak, sırasıyla, üstteki sıvı toplandı ve üstteki sıvı endotoksini uzaklaştıran kaplara dolduruldu.

 

1.2.4 Mikrofiltrasyon membran kaseti berraklaştırması

Membran, tek yönde 10L saf su ile yıkandı ve teğetsel akış filtrasyonu gerçekleştirildi. Santrifüjlemeden sonra kırılmış bakteri süspansiyonunun 300 mL'si boru hattı santrifüjünden alındı ​​ve 0,45um mikrofiltrasyon membran kaseti ile berraklaştırıldı. Bulanıklık sırasıyla örnekleme ile ölçüldü ve santrifüjlemeden sonraki bulanıklık, mikrofiltrasyon membran kasetindeki berraklaştırılmış sıvının bulanıklığı ve mikrofiltrasyon membran kasetindeki konsantre sıvının bulanıklığı karşılaştırıldı. Numunenin protein içeriği, protein verimini değerlendirmek için kromatografi ve elektroforez ile tespit edildi.

 

Adım 2: Sonuçlar

2.1 BL21-HP1036 ve BL21-palA proteininin açıklama verileri ve test sonuçları

Şekil 1'deki sonuçlar, BL21-HP1036 ve BL21-palA rekombinant Escherichia coli kırma sıvısının bulanıklığının tüp santrifüjlemesinden sonra sırasıyla 4 500 NTU ve 4 000 NTU'dan 1970 NTU ve 520 NTU'ya düştüğünü göstermektedir. BL21-HP1036 ve BL21-palA rekombinant Escherichia coli'nin bulanıklığı mikrofiltrasyon membran kaset yöntemi ile 25 NTU ve 1,28 NTU'ya düşürülmüştür. Mikrofiltrasyon membran kaset teğetsel akış filtrasyonunun ve optimize edilmiş açık akış kanalının kullanımının, geleneksel santrifüj filtrasyonundan daha iyi bir şekilde endotoksin, viskozite ve kromatografik sıvının bulanıklığını azalttığı ve kırılmış rekombinant E. coli heteroproteinini ve nükleik asidi önemli ölçüde azaltabildiği görülebilir.

 

2.2 BL21-HP1036 ve BL21-palA örneklerinin protein geri kazanımı

Tablo 1, rekombinant Escherichia coli BL21-HP1036 proteininin hem mikrofiltrasyon berraklaştırılmış solüsyonda hem de mikrofiltrasyon membranıyla kaplı konsantre üst sıvıda bulunduğunu ve proteinin mikrofiltrasyon berraklaştırılmış solüsyondan ve konsantre üst sıvıdan geri kazanılmasından sonraki toplam protein veriminin yaklaşık %88,5 olduğunu göstermektedir. BL21-palA proteini ayrıca mikrofiltrasyon eksüdat berraklaştırılmış solüsyonda ve mikrofiltrasyon membran kasetiyle kaplı konsantre solüsyonun üst sıvısında da mevcuttu. BL21-PALa proteininin toplam verimi %81,5 idi.

 

3. Sonuç

Bu makalede, Streptococcus suis ve Haemophilus parasuis'in sırasıyla BL{{0}}HP1036 ve BL21-palA anahtar genlerini ifade eden suşlar yüksek yoğunluklu fermantasyona tabi tutulmuş ve %0,45'lik bir pH'ı geçmiştir. Malzeme sıvısının bulanıklığı mikrofiltrasyon membran kaset işlemi ile önemli ölçüde azaltılmıştır; bu da mikrofiltrasyon membran kasetli teğetsel akış filtrasyon teknolojisinin yüksek hızlı santrifüjlü olandan daha iyi olduğunu ve kırılmış rekombinant Escherichia coli'nin safsızlık proteinini ve nükleik asidini önemli ölçüde azaltabileceğini göstermektedir.

 

Tek mikrofiltrasyon membran kasetinde berrak sıvı toplandıktan sonra, BL{4}}HP1{7}}36'nın hedef proteininin %37,1'i mikrofiltrasyon konsantresi olduğundan veya mikrofiltrasyon membran kasetinde mevcut olduğundan ve diğer kayıplardan dolayı, berraklaştırma için iki aşamalı bir yöntem benimsendi. İlk adımda, eksüdayı berraklaştırmak ve toplamak için 0,45 um'lik mikrofiltrasyon membran kaseti kullanıldı; ikinci adımda, kalan konsantre sıvı tüp santrifüjlemesinden sonra toplandı ve iki aşamalı berraklaştırılmış sıvı kromatografik numune olarak birleştirildi. BL{9}}palA fermantasyon sıvısının bulanıklık değeri önemli ölçüde artmadı, protein verimi %85,5'in üzerine çıkabildi ve BL{12}}Pala fermantasyon sıvısının protein verimi iki aşamalı işlemden sonra %81,5'e ulaşabildi.

 

Mikrofiltrasyon membran kasetinin nasıl seçileceğine gelince, Guidling Technology size yüksek kaliteli çözümler sağlayabilir. Mikrofiltrasyon membran kaset ve ultrafiltrasyon membran kaset serisi ürünlerimiz, biyoteknoloji için özel olarak tasarlanmış taşıyıcı olarak polieter sülfon kullanır. Polieter sülfon membranımız yüksek verim, düşük protein adsorpsiyonu, yüksek mekanik mukavemet, darbe direnci vb. avantajlara sahiptir. Giriş ve çıkış basıncını gerçek zamanlı olarak ölçmek için size özel membran kelepçeleri sağlıyoruz ve özel ultrafiltrasyon/mikrofiltrasyon sisteminizi özelleştirmek için ihtiyaçlarınıza göre teknik ziyaretler sağlayabiliriz. Böyle küçük bir teğetsel akış sistemi, küçük, pilot ve küçük ölçekli üretim için kullanılabilir ve test gereksinimlerinizi ve üretim gereksinimlerinizi tam olarak karşılamak için tamamen doğrusal amplifikasyon olabilir.

Guidling Hakkında

Guidling Technology, biyofarmasötikler, hücre kültürü, biyomedikal, tanı ve endüstriyel sıvıların saflaştırılması ve konsantrasyonu üzerine odaklanan ulusal bir yüksek teknoloji kuruluşudur. Santrifüj filtre cihazları, ultrafiltrasyon ve mikrofiltrasyon kasetleri, virüs filtresi, TFF sistemi, derinlik filtresi, içi boş elyaf vb.'yi başarıyla geliştirdik. Bunlar biyofarmasötiklerin, hücre kültürünün vb. uygulama senaryolarını tam olarak karşılar. Membranlarımız ve membran filtrelerimiz, ön filtrasyon, mikrofiltrasyon, ultrafiltrasyon ve nanofiltrasyonun konsantrasyonu, ekstraksiyonu ve ayrılmasında yaygın olarak kullanılır. Küçük, tek kullanımlık laboratuvar filtrasyonundan üretim filtrasyon sistemlerine, sterilite testine, fermantasyona, hücre kültürüne ve daha fazlasına kadar birçok ürün hattımız, test ve üretim ihtiyaçlarını karşılar. Guidling Technology sizinle işbirliği yapmayı dört gözle bekliyor!