Ultrafiltrasyon tüpünün kullanımı için önlemler
(1) Uygun ultrafiltrasyon tüpünü seçin. Genel olarak tutulacak moleküler ağırlık, hedef proteinin moleküler ağırlığının 1 / 3'ünden fazla olmamalıdır. Örneğin, hedef proteinin moleküler ağırlığı 35kDa ise, 10kDa moleküler ağırlığa sahip ultrafiltrasyon tüpü seçilebilir. Hedef proteinin moleküler ağırlığı yaklaşık 10kd ise, moleküler ağırlığı 3KD olan bir ultrafiltrasyon tüpü kullanılabilir. Kullanım kılavuzunu dikkatlice okuyun ve ultrafiltrasyon membranının çeşitli kimyasallara karşı farklı toleranslarına dikkat edin.
(2) Yeni satın alınan ultrafiltrasyon kuru. Kullanmadan önce ultra saf su ekleyin, su tamamen zardan geçecektir. Bir buz banyosunda veya buzdolabında birkaç dakika önceden soğutun. Sonra suyu dökün ve protein solüsyonunu ekleyin. Eklenen miktar, tüpün üstündeki beyaz çizgiyi geçmemelidir. İşlem hafif olmalıdır. Protein solüsyonu eklemeden önce, ultrafiltrasyon tüpünün ön soğutma için buz üzerine yerleştirilmesi gerekir.
(3) Denge. Hem kütle hem de ağırlık merkezi dengelenmelidir. Hız ve ivmenin çok hızlı olmaması gerektiğini unutmayın, aksi takdirde ultrafiltrasyon membranı doğrudan hasar görür. Santrifüjlü ultrafiltrasyonu başlatın (4 dereceye kadar santrifüj ön soğutma). Farklı santrifüjlerin RPM'si G'ye dönüştürüldükten sonra farklıdır. Membran üzerindeki basıncı azaltmak için santrifüjün ivmesini en düşük vitese ayarlayın. Santrifüjden ayrılmadan önce santrifüjün hedef hıza ulaşmasını beklemeniz gerektiğini unutmayın, aksi takdirde santrifüjde bir sorun olduğunda ilk seferde bununla baş edemezsiniz. Membranın ve dönen şaftın yönü, talimatlara göre ayarlanmalıdır (açılı dönen santrifüj durumunda, membran şafta diktir). Pratik kullanımda, hız genellikle kılavuzdakinden daha düşüktür, bu da santrifüj borunun hizmet ömrünü uzatabilir.
(4) Kalan 1 ml'ye konsantre edildiğinde, 50ul tampon solüsyonu alın ve ultrafiltrasyon tüpünün protein sızdırıp sızdırmadığını değerlendirmek için maviye dönüp dönmediğini görmek için akmak üzere 10ul ekleyin. Tüp sızdırırsa, üst tabakayı dökün ve yeni tüpten akıtın ve ultrafiltrasyona başlayın. Tüpün sızdırıp sızdırmadığını doğru bir şekilde değerlendirmek için, 10 dakika boyunca 5 mgml BSA ile santrifüjleyin, ardından akışı alın, kaba ölçüm için protein tutkalı veya Bradford çalıştırın ve konsantrasyon için kalan protein solüsyonunu eklemeye devam edin (proteini önlemek için buz üzerinde çalıştırın). ısıtılır) tüm konsantre çözeltiler eklenene kadar. Santrifüjleme sırasında protein çökelmesinin boru tıkanmasıyla sonuçlanıp sonuçlanmadığına dikkat edin. Çökelme meydana gelirse, protein konsantrasyonunun çok yüksek olup olmadığını veya tamponun uygunsuz olup olmadığını, çökelmenin spesifik nedenini belirleyin; İlki, konsantrasyonu azaltmak için çoklu ultrafiltrasyon tüpleri ile aynı anda ultrafiltrasyonla çözülebilir. İkincisi, protein çökene kadar farklı tampon çözeltilerini değiştirmektir.
(5) Proteini konsantre etmek için önceki adımlar kullanılır. Tamponu değiştirmek istiyorsanız, toplam protein solüsyonu yaklaşık 1 ml'ye konsantre olduğunda, yavaşça yeni bir tampon ekleyin (0.22um ultrafiltrasyon membranından ultrafiltrasyon) ve ardından art arda üç kez yaklaşık 1 ml'ye konsantre edin. Son konsantrasyonun nihai hacmi, genellikle 500 ul'den fazla olmayan gerekli protein konsantrasyonuna bağlıdır veya 200 ul'den daha azına konsantre edilebilir. Her seferinde en az 10 kez hacim konsantrasyonuna göre, temel olarak tamponu değiştirme amacına ulaşabilen üç kez 1000 defadan fazla ulaşabilir.
