Doğal Kolajen Ekstraksiyonunda Ultrafiltrasyon Uygulaması

Doğal bir protein kaynağı olan kolajenin iyi biyouyumluluğu, düşük antijenitesi, biyobozunurluğu ve hemostazı, sıkı sarmal yapısı ve kendine has özellikleri vardır ve bunların hepsi endüstrileşmesinin ön koşullarını sağlar. Kolajen ve yan ürünleri sadece ambalaj malzemesi, kozmetik ve sağlık ürünleri olarak değil, aynı zamanda et ürününü iyileştirmek için gıda katkı maddesi olarak da kullanılmakta ve özellikle tıp alanında önemli bir rol oynamaktadır.

 

Kolajen Nedir??

 

Kolajen biyolojik bir makromoleküldür, hayvan bağ dokusunun ana bileşenidir ve memelilerde en bol bulunan ve yaygın olarak dağıtılan fonksiyonel proteindir; toplam proteinin %25 ila %30'unu ve hatta bazı organizmalarda %80 veya daha fazlasını oluşturur. Hayvan hücrelerinde doku bağlama görevi görür.

Bir yetişkinin vücudunda, esas olarak insan derisinde, kemiklerde, gözlerde, dişlerde, tendonlarda, iç organlarda (kalp, mide, bağırsaklar, kan damarları dahil) ve insan vücudunun diğer kısımlarında bulunan yaklaşık 3 kg kolajen bulunduğu ölçülür. Görevi derinin, doku ve organların morfolojisini ve yapısını korumaktır ve aynı zamanda yaralanma sonrası çeşitli dokuların onarımı için de önemli bir hammaddedir.

 

Kollajen proteininin birçok türü vardır ve yaygın türleri tip I, tip II, tip III, tip V ve XI'dir. İyi biyouyumluluğu, biyolojik olarak parçalanabilirliği ve biyoaktivitesi nedeniyle kolajen gıda, ilaç, doku mühendisliği, kozmetik ve diğer alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır.

Doğal kollajen nasıl çıkarılır

Çiftlik hayvanlarından ve kümes hayvanlarından elde edilen hayvan dokuları, insanların doğal kolajen ve kolajen peptidlerini elde etmesinin ana yoludur. Ancak ilgili hayvan hastalıkları ve bazı dini inançlar nedeniyle insanların kara memelilerinden elde edilen kolajen ve ürünlerini kullanımı sınırlı kalmakta ve gelişim giderek Deniz organizmalarına yönelmektedir. Avrupa Gıda Güvenliği Otoritesi (EFSA), hayvan kemiklerinden elde edilen kolajenin bile deli dana hastalığını ve diğer ilgili hastalıkları enfekte etme potansiyeline sahip olmadığını doğruladı. Amino asit bileşimi ve çapraz bağlanma derecesindeki farklılıklar nedeniyle suda yaşayan hayvanlar, özellikle deri, kemik ve pul gibi işleme artıkları açısından zengin olan kolajen, hayvancılık kolajeninin sahip olmadığı birçok avantaja sahiptir. Ek olarak, Deniz hayvanlarından elde edilen kolajen, düşük antijenite ve hipoalerjenite gibi bazı yönlerden kara hayvanlarından elde edilen kolajenden açıkça üstündür. Bu nedenle sudaki kolajen yavaş yavaş karasal hayvan kolajeninin yerini alabilir. Örnek olarak ot sazanı balık pullarından kolajen çıkarma işlemi alınmıştır.

 

Ot sazanı balık pullarından ultrafiltrasyon yöntemiyle kollajenin ekstraksiyonu

1. Malzemeler ve yöntemler

1.1 Test örneği

Ham kollajen sulu ekstraktı.

1.2 Test yöntemleri

1.2.1 Ultrafiltrasyon proses rotası

 

1.2.2 Ön filtreleme işleminin belirlenmesi

Bu testte, en iyi ön filtreleme filtreleme sürecini belirlemek için vakumlu filtreleme yöntemi ve mikrofiltrasyon yöntemi karşılaştırılır ve analiz edilir. Spesifik test yöntemleri aşağıdaki gibidir:

① Ham kollajen su ekstraktı, su ekstraktındaki asılı parçacıkları ve yabancı maddeleri çıkarmak için filtre kağıdının vakumla pompalanmasıyla filtrelendi.

② Ham kollajen su ekstraktı, su ekstraktındaki çözünmeyen maddeyi ve yabancı maddeleri çıkarmak için 0.2μm mikrofiltrasyon membranı ile filtrelendi.

 

1.2.3 Ultrafiltrasyon membranı gözenek boyutunun seçimi

Ultrafiltrasyon membranının gözenek boyutu 100 kDa idi.

 

1.2.4 Ultrafiltrasyon saflaştırma işleminin tek faktörlü deneyi

Ham kollajen su ekstraktının saflaştırılması için ultrafiltrasyon teknolojisi kullanılmış ve çalışma basıncı, çalışma sıcaklığı ve pH değerinin kollajen tutulmasına etkileri üzerine tek faktörlü deneyler incelenmiştir. Ultrafiltrasyon ekipmanı bir süre çalıştırılıp stabil hale getirildikten sonra çeşitli faktörlerin kollajen tutulumu üzerindeki etkisi araştırıldı.

 

1.2.5 Hesaplama Formülü

 

2. Sonuçlar ve analiz

2.1 Ön filtreleme işleminin analiz sonuçları

Vakumlu ekstraksiyon ve mikrofiltrasyondan oluşan iki filtreleme yönteminin karşılaştırma sonuçları aşağıdaki tabloda gösterilmektedir.

 

Tablodan hem vakum filtrasyon yönteminin hem de mikrofiltrasyon yönteminin çözeltideki yabancı maddeleri ve çözünmeyen katıları giderebildiği, ancak mikrofiltrasyon yönteminin proteinler üzerinde daha iyi koruyucu etkiye sahip olduğu, yani kaybın belirgin olmadığı ve vakum filtrasyon yönteminin daha iyi olduğu görülmektedir. protein kaybına neden olmak kolaydır. Ek olarak, vakumlu filtrasyon yöntemi, filtrat bir süre yerleştirildikten sonra bulanıklık gösterir ve mikrofiltrat hala berrak ve şeffaftır, bu nedenle ultrafiltrasyonun ön arıtma işlemi olarak mikrofiltrasyon seçilir.

 

2.2 Ultrafiltrasyon işleminin tek faktörlü testi

2.2.1 Ultrafiltrasyon basıncının tutma oranı üzerindeki etkisi

40 derece sıcaklık ve pH=9.0 koşulu altında, farklı ultrafiltrasyon basınçlarının etkisi (0.07MPa, {{9} }.09MPa, 0,11MPa, 0,13MPa ve 0,15MPa) protein tutulumu üzerinde çalışıldı. Sonuçlar aşağıdaki şekilde gösterilmektedir.

Yukarıdaki şekilde görüldüğü gibi çalışma basıncının artmasıyla birlikte protein tutma oranı giderek azalmaktadır. Çalışma basıncı {{0}}.07MPa olduğunda protein tutma oranı %96,53, çalışma basıncı 0,15MPa olduğunda protein tutma oranı %84,38'dir. Bunun nedeni, ultrafiltrasyonun maddeler üzerindeki ayırma etkisinin basınç farkıyla gerçekleştirilmesidir. Düşük çalışma basıncı aralığında, küçük moleküller membrandan hızla geçebilirken, büyük moleküller ultrafiltrasyon membranı tarafından yakalanıp membran yüzeyinde birikebilir. Bu sırada membran yüzeyi ve su ekstraktı bir konsantrasyon farkı oluşturarak konsantrasyon polarizasyon direncine neden olur. Şu anda basınç nispeten düşüktür ve tutma oranı üzerinde büyük bir etkiye sahip olamaz. Ancak basıncın artmasıyla birlikte konsantrasyon polarizasyon direnci giderek artar ve membran yüzeyi ile su ekstraktı arasındaki konsantrasyon farkı dengeye ulaşır. Basınç bu dengeyi aştığında membran yüzeyinde bir jel tabakası oluşabilir (bu, ultrafiltrasyon sırasında konsantrasyon polarizasyonu ve yoğunlaşma tabakasının oluştuğu teorisiyle tutarlıdır) ve basınç artmaya devam eder, jel tabakasının kalınlığı artar. ve membran yüzeyinde kalan protein de artar. Bu, daha düşük bir tutma oranına neden olur. Membranın ayırma etkisini sağlamak için optimum çalışma basıncı parametresi 0,07MPa'dır.

 

2.2.2 Sıcaklığın protein tutulması üzerindeki etkisi

{{0}}.11MPa basınç ve pH=9.0 koşulları altında, farklı sıcaklıkların, yani 25 derece, 30 derece, 35 derece, 40 derece ve 45 derecenin protein üzerindeki etkileri tutulması araştırıldı. Sonuçlar aşağıdaki şekilde gösterilmektedir.

Yukarıdaki şekilde görüldüğü gibi ultrafiltrasyon membranının tutma oranı sıcaklık artışıyla birlikte giderek artmakta ve 45 derecede maksimuma ulaşarak %97,01 tutma oranına ulaşmaktadır. Bunun nedeni kolajenin viskozitesinin sıcaklıkla yakından ilişkili olmasıdır. Sıcaklık düşük olduğunda, kollajenin viskozitesi artar ve membran yüzeyinde kollajenin birikmesinin direnç oluşturması kolaydır, bu da düşük tutma oranına neden olur. Sıcaklık arttığında kollajenin viskozitesi azalır, kollajen molekülleri arasındaki etkileşim zayıflar, kütle aktarım hızı artar, konsantrasyon polarizasyon fenomeni zayıflar ve tutma oranı artar. Tutma oranının artmasının bir başka nedeni de sıcaklığın artması, kolajenin çözünürlüğünün de buna bağlı olarak artması ve kolajenin membranı bloke etme olgusunun azalmasıdır, dolayısıyla ultrafiltrasyonun optimal sıcaklığı 45 derecedir.

 

2.2.3 pH değerinin protein tutulmasına etkisi

{{0}}.11MPa basınç ve 40 derece sıcaklık koşulları altında, farklı pH koşullarının etkisi, yani pH=6.0, pH{{ 5}}.{{10}}, pH=8.0, pH=9.0 ve pH=10.0'ın tutma oranı üzerinde çalışıldı. Sonuçlar aşağıdaki şekilde gösterilmektedir.

 

As can be seen from the figure above, in the range of pH 6-7, the protein retention rate decreases with the increase of pH value, and the minimum value is 82.13% when pH=7.0; when pH>7, the retention rate gradually increases with the increase of pH value. This is because the isoelectric point of collagen is pH=7. At the isoelectric point, the protein is in a state of precipitation, which is easy to stay on the surface of the membrane and block the membrane, thus reducing the retention rate. When pH>Şekil 7'de pH değerinin artmasıyla birlikte tutma oranı giderek artmaktadır. Bunun nedeni, ultrafiltrasyon membranının negatif yüklü polieter akçaağaç membranı olması ve kolajenin alkali koşullar altında negatif yüklü olmasıdır. Negatif yüklü kollajen molekülleri, aynı yüke sahip ultrafiltrasyon membranı ile birbirini dışlayan bir durum oluşturur, dolayısıyla kollajen moleküllerinin membran yüzeyinde kalması ve membranı bloke etmesi kolay değildir. Bu nedenle ultrafiltrasyonun optimal pH değeri 8-10'dir.

 

2.3 Ultrafiltrasyon proses optimizasyonu ve sonuç doğrulama

Design-Expert8.05 yazılımının analizine göre, optimum proses parametreleri şunlardır: çalışma basıncı 0.14MPa, çalışma sıcaklığı 40.98 derece, çözelti pH'ı{{7 }},43 ve elde tutma oranı %92,551'dir. Gerçek parametrelerin çalışabilirliği dikkate alınarak ultrafiltrasyon koşulları 0,14MPa çalışma basıncı, 40 derece çalışma sıcaklığı ve malzeme çözeltisinin 9,50 pH değeri olarak seçilmiş olup, ultrafiltrasyon sistemi çalıştırılıp stabil hale getirildikten sonra test doğrulamasına geçilmiştir. Tutma oranının sonucu (92,61±0,1) % (n=3) idi. Denklemin tahmin edilen değerleri temel olarak ölçülen değerlere benzer, bu da tahmin edilen durum parametresi sonuçlarının gerçek durum sonuçlarıyla uyum içinde olduğunu gösterir.

 

2.4 Elektroforetik analiz sonuçları

Saflaştırılmış kolajen SDS-PAGE elektroforezi ile analiz edildi ve sonuçlar aşağıdaki şekilde gösterildi.

 

Yukarıdaki şekilde görülebileceği gibi, şerit 1 bu testin saflaştırılmış kolajenidir ve şerit 2, baldır tendonunun standart kolajen numunesidir. Bu çalışmadaki kolajenin kolajen olarak tanımlanabileceği SDS-PAGE elektroforezinden görülebilmektedir ancak a1 peptid zinciri ile a2 peptid zinciri arasındaki sınırlar net değildir. Elektroforetik haritadan başka protein safsızlığının olmadığı görülebildiğinden saflaştırılmış kolajenin saflığının yüksek olduğu sonucuna varılabilir.

Rehberlik Hakkında

 

Guidling Technology, biyofarmasötikler, hücre kültürü, biyomedikalin saflaştırılması ve konsantrasyonu, teşhis ve endüstriyel sıvılara odaklanan ulusal bir yüksek teknoloji kuruluşudur. Biyofarmasötikler, hücre kültürü vb. uygulama senaryolarını tam olarak karşılayan santrifüj filtre cihazlarını, ultrafiltrasyon ve mikrofiltrasyon kasetlerini, virüs filtresini, TFF sistemini, derinlik filtresini, içi boş fiberi vb. başarıyla geliştirdik. Membranlarımız ve membran filtrelerimiz, ön filtreleme, mikrofiltrasyon, ultrafiltrasyon ve nanofiltrasyonun konsantrasyonu, ekstraksiyonu ve ayrılmasında yaygın olarak kullanılmaktadır. Küçük, tek kullanımlık laboratuvar filtrelemesinden, üretim filtreleme sistemlerine, sterilite testlerine, fermantasyona, hücre kültürüne ve daha fazlasına kadar birçok ürün grubumuz, test ve üretim ihtiyaçlarını karşılamaktadır. Guidling Technology sizinle işbirliği yapmayı dört gözle bekliyor!