Besleme konsantrasyonunun ultrafiltrasyon kasetleri üzerindeki etkisi nedir?

Filtre tedarikçisi olarak ilk günlerimde ultrafiltrasyon (UF) kasetleriyle ilk çalışmaya başladığımda, işlediğim çözeltinin "yeterince kalın" olup olmadığını kontrol etmenin ötesinde besleme konsantrasyonunu pek düşünmediğimi itiraf etmeliyim. Bu durum hızla değişti; bir biyoteknoloji müşterisi, sık sık tıkanmayı ve garip biçimde tutarsız akı oranlarını suçlayarak antikor konsantrasyonu adımını duvara çarptığında. UF kasetlerinin kaldırabileceğinden çok daha fazlasını zorladıkları ortaya çıktı ve bu onlara günlerce kesintiye ve bir sürü pahalı ürüne mal oldu. UF kasetleriyle çalışıyorsanız bu sadece küçük bir ayrıntı değildir; verimden çalışma süresine kadar sürecinizi oluşturan veya bozan en büyük kaldıraçlardan biridir. Yem konsantrasyonunun UF'nin her bölümünü nasıl etkilediğini ve işlerin düzgün yürümesi için yıllar içinde neler öğrendiğimi açıklayalım.

Öncelikle aynı fikirde olduğumuzdan emin olmak için bunu UF kasetlerinin gerçekte ne yaptığına dayandıralım. Oyunda yeniyseniz UF kaseti düz membranlı bağımsız bir ünitedir (bkz.Düz Sac KasetMolekülleri boyutlarına göre ayıran, küçük maddeler zardan geçerken, daha büyük olanlar "tutulur" ve besleme tarafında yoğunlaşır. Bunları biyofarmasötik, yiyecek ve içecek ve atık su alanlarında bu kadar popüler kılan şey nedir? Kompakttırlar, yeniden kullanılabilirler (bazen doğru temizlenirlerse) ve eski, elle kesilmiş membran kurulumlarından çok daha tutarlıdırlar.Kasetler UltrafiltrasyonSunduğumuz seri, küçük laboratuvar gruplarından tam üretime kadar ölçeklenebilir çalışmalar için üretilmiştir; bu nedenle yeni kurulan biyoteknolojilerden küresel gıda markalarına kadar çeşitli müşterilerle çalıştık.

Terminolojiyi derinlemesine incelememiş olanlar için besleme konsantrasyonu, temel olarak kasete pompaladığınız çözeltideki hedef (veya istenmeyen) çözünen madde miktarıdır. Örneğin, bir hücre kültürü besiyerinden monoklonal antikorları (mAb'ler) konsantre ediyorsanız buradaki yem konsantrasyonu, o besiyerinin litresi başına kaç gram mAb olduğunu gösterir. Bu sadece hedef değil; hücre artıkları, medya bileşenleri ve artık tampon tuzları gibi yabancı maddeler de karışmış durumda. Yem konsantrasyonu için en uygun nokta, membranınızın moleküler ağırlık sınırına (MWCO) bağlı olarak farklıdır, değil mi? 30KD'lik bir UF kaseti küçük proteinler için harika çalışırken, 500KD'lik bir kaset viral vektörler gibi daha büyük moleküller için idealdir. Müşterilerin yem konsantrasyonlarına bakılmaksızın baktıkları ilk kaseti aldıklarını gördüm ve hataların başladığı yer burasıdır.

En acil etkiyle başlayalım: akı oranı. Akı, saatte birim alan başına membrandan geçen çözelti hacmidir; UF üretkenliğinin omurgasıdır. Yem konsantrasyonunuz çok yüksek olduğunda akı doğrusal bir şekilde değil hızlı bir şekilde düşer. Nedeni şu: Çözeltiyi işlerken, tutulan çözünenler membran yüzeyinin yakınında birikerek "konsantrasyon polarizasyon katmanı" adı verilen şeyi oluşturur. Bu katman ekstra bir bariyer görevi görüyor, dolayısıyla su ve küçük çözünen maddelerin içinden geçmek için daha fazla çalışması gerekiyor. Besleme konsantrasyonu başlangıçta ekstra yüksekse, polarizasyon katmanı hızlı bir şekilde kalınlaşır ve çok geçmeden neredeyse hiçbir nüfuzu içeri itemezsiniz. Geçen yıl yoğun bir hücre kültürü süpernatanı üzerinde 30KD Ultrafiltrasyon Kaseti çalıştıran bir müşterim vardı; bizim önerimiz 10-15 g/L iken onlar 25 g/L proteinle besleniyorlardı. Akışları 2 saat içinde 60 L/m²/saatten 12 L/m²/saat'e düştü ve kaseti vaktinden önce temizlemek için kapanmak zorunda kaldılar, bu da 12 saatlik çalışma süresini boşa harcadı. Daha da kötüsü, yüksek konsantrasyonlu polarizasyon bazı proteinlerin bu katmanda sıkışmasına neden oldu, dolayısıyla verimleri beklenenden %18 daha düşüktü.

Ancak bu sadece akı değil; yem konsantrasyonu aynı zamanda UF'nin en büyük öcüsü olan membran kirlenmesine de doğrudan bağlıdır. Kirlenme, çözünen maddelerin, kalıntıların veya agregatların membran yüzeyine veya gözenek duvarlarına kalıcı olarak yapışmasıdır ve aşırı konsantre beslemelerde bu durum çok daha kötüdür. Çözünen maddeler yemde bir araya toplandığında, bunların zarla çarpışıp sıkışıp kalma olasılıkları daha yüksektir. Yıllar boyunca yüzlerce UF kasetini temizledim ve bunların %80'inde, önerilen aralığın 2-3 katı yem konsantrasyonuna kadar ağır kirlenme izleri oluştu. Örneğin, meyve suyu işleyen bir gıda müşterisi, 15° Brix (10KD kasetleri için en uygun nokta) yerine tek geçişte 30° Brix'e konsantre olmak istiyordu. Meyve suyunun pektini ve şekeri 30 dakika içinde membran üzerinde birikmeye başladı ve çalışmanın sonunda membran gözenekleri kısmen tıkandı, dolayısıyla bekledikleri konsantrasyonun yalnızca dörtte birini elde ettiler ve 10 yerine üç çalıştırmadan sonra kaseti değiştirmek zorunda kaldılar. Bu, konsantrasyonu her seferinde daha düşük bir yem konsantrasyonuyla iki geçişe bölmeleri durumunda litre başına çok daha yüksek maliyete neden oldu.

Verim, özellikle ürünün her gramının önemli olduğu biyofarma alanında, yem konsantrasyonunun en çok darbe aldığı başka bir alandır. Yeminiz çok konsantre olduğunda, yalnızca daha fazla kirlenmekle kalmaz, aynı zamanda iki şekilde ürün kaybı da görmeye başlarsınız. Birincisi, konsantrasyon polarizasyon katmanı hedef molekülleri yakalayabilir ve eğer çok kalınlaşırsa, bu moleküller, kaseti boşalttığınızda konsantre olmak yerine, tutulan kısımla birlikte uzaklaşabilir. İkincisi, bazı hedef moleküller (proteinler gibi) yüksek konsantrasyonlarda toplanmaya başlayabilir ve bu birikintiler genellikle membrandan kayacak veya süzüntüde sıkışıp kalacak kadar küçüktür, dolayısıyla onları kaybedersiniz. Geçen yıl birlikte çalıştığım bir viral vektör müşterisi, AAV vektörlerini yoğunlaştırmak için 500KD Ultrafiltrasyon Kasetimizi kullanıyordu; yem konsantrasyonunu mL başına 1e13 vektör genomuna ittiler; bu da bizim 2e12 önerimizin çok üzerindeydi. Verimleri yalnızca %45'ti; oysa yem konsantrasyonunu doğru aralığa düşürdüklerinde elde ettikleri %82'ydi. Tutulan kısmı test ettiğimizde, hedef vektörlerinin %30'unun konsantrasyon polarizasyon katmanında sıkışıp kaldığını ve diğer %15'inin toplanıp kaybolduğunu bulduk. Bu, özellikle bir anlık hevesle daha fazla ürün üretemeyeceğiniz GMP uyumlu süreçlerle uğraşırken, tüm partiyi değersiz hale getirebilecek türden bir darbedir.

Durun ama "düşük yem konsantrasyonunun her zaman daha iyi olduğunu" düşünmeden önce bu da doğru değil. Beslemeniz çok seyreltilmişse, zamanınızı ve kaset kapasitenizi boşa harcıyorsunuz demektir. UF, çözümü makul bir seviyede konsantre ettiğinizde en verimli yöntemdir, ancak çok ince bir beslemeyle başlarsanız, ihtiyaç duyduğunuzdan çok daha fazla hacim taşırsınız, bu da pompalama için enerji maliyetlerini artırır ve hedef konsantrasyonunuza ulaşmanız daha uzun sürer. Örneğin, küçük bir protein numunesini konsantre eden bir laboratuvar müşterisi, yem konsantrasyonu 0,1 mg/mL olan 10KD'lik bir kaset kullanıyordu; 10 mg/mL'ye ulaşmaya çalışıyorlardı, dolayısıyla 10 mL filtrelenmemiş kısım elde etmek için 100 mL çözelti işliyorlardı. Yemi ilk önce santrifüj yoluyla 0,5 mg/mL'ye konsantre ettiklerinde bu süre 8 saate karşılık 2 saat sürdü, böylece yalnızca 20 mL işlediler. Bu, özellikle günde birden fazla parti çalıştırıyorsanız, emek ve zaman açısından büyük bir farktır. Anahtar, özel kasetiniz ve uygulamanız için benim "konsantrasyon penceresi" dediğim orta aralığa ulaşmaktır.

Peki bu konsantrasyon penceresini nasıl anlarsınız? Bu herkese uyacak tek bir kalıp değil, ancak tüm müşterilerimizle paylaştığımız birkaç temel kural var. Öncelikle kasetinizin MWCO'sunu kontrol edin: MWCO'su daha yüksek (500KD gibi) bir kaset genellikle daha düşük MWCO'lu bir kasetten (30KD gibi) daha yüksek bir besleme konsantrasyonuyla başa çıkabilir, çünkü gözenekler daha büyüktür, dolayısıyla polarizasyon daha az sorun olur. BizimKasetler-TFF-filtrasyon SerisiSayfada her kaset için belirli konsantrasyon aralıkları vardır, ancak genel bir kural olarak, çoğu protein uygulaması için toplam katıların %10-15'inin ve küçük moleküller için asla %5-10'un üzerine çıkmayın. İkinci olarak, yeminizi yabancı maddeler açısından test edin: Yeminizde çok fazla kalıntı veya topak varsa, hedef molekülünüz ne olursa olsun, kirlenmeyi önlemek için daha düşük bir yem konsantrasyonuna ihtiyacınız vardır. Üçüncüsü, önce küçük ölçekli testler yapın; tam üretime geçmeyin. 100 mL veya 1 L'lik bir test çalıştırması size tam olarak hangi akı elde ettiğinizi, ne kadar hızlı kirlenme oluştuğunu ve ne kadar verim beklediğinizi söyleyecektir, böylece değerli ürünü israf etmezsiniz.

Yıllar boyunca fark ettiğim başka bir şey de yem konsantrasyonunun çapraz akış hızı ve zar ötesi basınç (TMP) gibi diğer süreç parametreleriyle etkileşime girmesidir. Bu, vakumda konsantrasyonu ayarlamaya benzemez; eğer yüksek bir besleme konsantrasyonuna sahipseniz, polarizasyon katmanını membran yüzeyinden uzaklaştıran çapraz akış hızını artırarak ve TMP'yi artırarak bir miktar telafi edebilirsiniz (ancak çok fazla değil, çünkü TMP polarizasyon katmanının sıkışmasına neden olabilir). Ancak bu bir dengeleme eylemidir: Daha yüksek çapraz akış, daha fazla enerji anlamına gelir ve daha yüksek TMP, dikkatli olmazsanız membran hasarına yol açabilir. Müşterilerimize her zaman yem konsantrasyonunu da içeren tam parametre testlerini yapmalarını tavsiye ederiz, çünkü birini değiştirmek diğerlerinin başarısız olmasına neden olabilir. Örneğin, bir müşteri bir keresinde yüksek besleme konsantrasyonundan kaynaklanan akı düşüşünü TMP'yi artırarak düzeltmeye çalıştı ve sonunda membranı sıkıştırdı, böylece sonraki çalışmalarında daha da düşük akı elde edildi. Bu nedenle şirketimizde sadece kaset satmıyoruz; müşterilerimizin bu süreçteki aksaklıkları gidermelerine yardımcı oluyoruz çünkü yem konsantrasyonuyla ilgili yapabileceğiniz hemen hemen her hatayı gördük.

Uzun vadeli etkilerden de bahsedelim çünkü besleme konsantrasyonu yalnızca tek bir çalışmayı etkilemez; kasetin ömrünü de etkiler. Aşırı konsantre beslemelerle çalışıyorsanız, çok daha fazla kirlenmeye neden olursunuz, bu da kaseti daha sık temizlemeniz gerektiği ve birikintiden kurtulmak için daha agresif temizlik maddeleri (daha yüksek pH veya sıcaklık gibi) anlamına gelir. Zamanla, bu agresif temizlik membranı bozar, dolayısıyla değiştirilmesi gerekmeden kasetin içinde daha az çalışma olur. Düz Levha Kasetimizi çalıştıran bir müşterim vardı ve 5. çalıştırmada, yoğun kirlenme nedeniyle onu değiştirmek zorunda kaldılar; aynı kaseti doğru besleme konsantrasyonunda çalıştıran başka bir müşteri ise 15'ten fazla çalıştırma elde ediyordu. Kasetleri her hafta ve her ay incelediğinizde bu çok büyük bir maliyet farkıdır.

Şimdi pratik yapalım; yem konsantrasyonunuz bozuksa aslında ne yapmalısınız? İlk önce doğru şekilde ölçün. Pek çok müşteri çözümün "görsel kalınlığına" göre hareket ediyor ki bu da son derece hatalı. Kesin bir konsantrasyon elde etmek için gıda ürünleri için bir Brix ölçer veya absorbans (proteinler için A280 gibi) kullanın. Ardından, beslemenizi seyrelterek (çok yüksekse) veya çok düşükse daha küçük bir ön işleme adımıyla (farklı bir kasetle teğetsel akış filtreleme veya santrifüjleme gibi) daha da yoğunlaştırarak beslemenizi ayarlayın. Özel bir biyolojik yem gibi türünün tek örneği olan bir yemle uğraşıyorsanız ekibimize ulaşın; ister doğru MWCO'yu seçmek (30KD'ye karşı 500KD gibi), çapraz akışı ayarlamak veya en iyi çalışma süresini bulmak olsun, yem konsantrasyonunuza göre uyarlanmış bir süreç tasarlamanıza yardımcı olabilecek uygulama uzmanlarımız var.

Konsantrasyonu beslemek için ne kadar küçük ayarlamaların tüm UF sürecinizi değiştirebileceğini yeterince vurgulayamıyorum. Bu sıkıcı bir ayrıntı değil; tüm getiri ve zaman çizelgesi hedeflerinize ulaşan bir çalıştırma ile günlerce sorun gidermeye çalışmanıza, ürün ve para israfına neden olan bir çalıştırma arasındaki farktır. Kendimizi inşa ettikKasetler Ultrafiltrasyonfarklı MWCO'lara yönelik seçeneklerle (bizimki gibi) esnek olacak30kd Ultrafiltrasyon KasetleriVe500KD Ultrafiltrasyon Kasetleri), düz sayfa tasarımları ve TFF serisi kurulumları, çünkü her müşterinin beslemesinin farklı olduğunu biliyoruz. Yem konsantrasyonu sorunlarıyla mücadele ediyorsanız veya yalnızca UF sürecinizi daha verimli hale getirmek istiyorsanız, size yardımcı olmak için buradayız; konsantrasyon aralıklarını doğru ayarlamak için binlerce müşteriyle çalıştık ve sizin için de aynısını yapabiliriz. Yem konsantrasyonu gibi küçük bir ayrıntının koşularınızı mahvetmesine izin vermeyin; sürecinizi bugün optimize etme hakkında daha fazla bilgi edinmek için ekibimize ulaşın.

Referanslar

1. Belfort, G., Davis, RH ve Zydney, AL (1994). Çapraz akışlı mikrofiltrasyonda süspansiyonların ve makromoleküler çözeltilerin davranışı. Membran Bilimi Dergisi, 96(1–2), 1–58.
2. Charcosset, C. (2007). Ultrafiltrasyonda hidrodinamik ve konsantrasyon polarizasyonu: Bir inceleme. Tuzdan arındırma, 211(1–3), 108–122.
3. Zydney, AL (2018). Biyofarmasötik işleme için teğetsel akış filtrelemesi. Kimya Mühendisliğinde Güncel Görüş, 20, 109–115.
4. Mulder, M. (1996). Membran Teknolojisinin Temel Prensipleri (2. baskı). Kluwer Akademik Yayıncılar.