Membran Teknolojisi ve Aşı Berraklaştırma (Ⅱ)

Önceki yazıda aşılar ve aşı berraklaştırma stratejilerine dair bazı ön bilgiler vermiştik ve bu yazının geri kalanında bunları incelemeye devam edeceğiz. Yukarıdakilerin ardından aşı berraklaştırmalarını ve ilgili membran doku uygulamalarını paylaşmaya devam edeceğiz.

 

2.2.2 Virüsün fiziksel ve kimyasal özelliklerinin etkisi

Üretim sistemi ve arıtma adımında ilgili kirleticilerin giderilmesine yönelik yöntemler göz önünde bulundurulduktan sonra, virüsün özelliklerinin dikkate alınması ve virüs veriminin maksimize edilmesine odaklanılması önemlidir.

 

2.2.2.1 Kolay virüs adsorpsiyonu
Derin filtrasyon etkilerini iyileştirmek için pozitif yüklü malzemeler ve filtre yardımcıları (diyatomit gibi) geliştirilmiştir. Pozitif yük nükleik asitlerin ve HCP'nin yakalanmasını artırsa da, diyatomitin hücre artıklarını ve kolloidleri bağladığı bilinmektedir. Ancak, bu malzemeler virüsü adsorpsiyon mekanizmasıyla da tutabilir. Virüs genellikle çözeltide negatif yüklü olduğundan, pozitif yüklü filtreyle elektrostatik etkileşimler meydana gelebilir.
Virüsler ayrıca belirli filtre malzemeleriyle (diyatomit veya cam elyafı gibi) hidrofobik veya spesifik olmayan etkileşimleriyle de bağlanabilir. Zarflı virüsler, lipit zarfları nedeniyle bu adsorpsiyona daha duyarlıdır. Virüs elektrostatik etkileşimler yoluyla filtreye adsorbe edilirse ve virüs parçacıkları tuz rekabeti nedeniyle ayrılırsa, filtreyi yüksek iletkenliğe sahip bir tamponla yıkamak virüsü kısmen kurtarabilir. Ancak bu, HCP veya nükleik asitler gibi kirleticileri de elüe edebilir. Bu nedenle, daha inert polipropilen gibi alternatif bir filtre malzemesinin kullanımı tercih edilir.
Adenovirus is easily adsorbed, but different results have been confirmed. Using positively charged diatomite and deep filters. Borosilicate glass fiber filter material is also very well recovered. On the other hand, a patent proposed by Weggeman involving clarification of 20 – 40% adenovirus losses at PER, et al. Cell cultures were prepared with similarly positively charged deep filters containing diatomite. In this case, the nominal polypropylene filter showed a very high viral recovery rate (> 90%).
Grip virüslerinin berraklaştırma sırasında adsorpsiyon kaybına eğilimli olduğu iyi bilinmektedir. Bu nedenle, polipropilen bazlı filtre olan ücretsiz bir filtrenin kullanımı, grip koleksiyonunu berraklaştırmak için uygundur. Thompson ve arkadaşları, MDCK hücreleri tarafından üretilen hücre bazlı grip virüsünü berraklaştırmak için nominal olarak derecelendirilmiş 1,2 μ m polipropilen filtrenin ardından 0,45 μm PVDF membranın kullanıldığını bildirdi. 2 0 L ölçeğinde toplam dokuz saflaştırma testi gerçekleştirildi, 1,2 μ m polipropilen filtre için 111 L / m2 ve 0,45 μm PVDF filtre için 105 L / m2 yüklendi. Sonuçlar, çalışan virüslerin çoğunun iyi bir şekilde iyileştiğini gösterdi (%78-154). Ayrıca, hcDNA'nın %58'e kadar giderildiğini, ancak önemli bir HCP giderimi olmadığını bildirdiler.

 

2.2.2.2 Hassas virüslerin kırpılması

Bazı virüsler (kapsüllenmiş veya kapsüllenmemiş) düşük mekanik direnç gösterir ve santrifüjleme ve membran filtrasyon adımları sırasında kayma maruziyetiyle yok edilebilir. Filtrasyon veya kromatografi içeren saflaştırma adımları sırasında oluşan kayma kuvvetleri viral zarfın düşmesine neden olarak enfeksiyözlüğü etkileyebilir. Kapsidin boyutuna, kalınlığına ve geometrisine bağlı olarak viral kapsid kırılgan olabilir veya tam tersine yüksek basınçlara dayanıklı olabilir. Grip virüsleri gibi bazı zarflı virüsler mekanik strese elastiktir ve büyük deformasyonlara dayanabilir. Öte yandan kayma kuvveti retrovirüsler gibi daha az dirençli virüslerin zarfının düşmesine neden olarak virüsün enfeksiyözlüğünü etkileyebilir.

Hücre dışı üretilen zarf VLP'leri de oldukça savunmasızdır. Santrifüj işleminde, esas olarak giriş ve çıkış parçalarında yüksek kayma hızları üretilir (yüksek kayma hızları gaz-sıvı arayüzünde üretilir). Virüs gradyan santrifüjleme ile saflaştırıldığında, bazı retrovirüslerin transdüksiyon yeteneği önemli ölçüde zayıfladı. Santrifüjlü ayırma tasarlanırken, viral parçacıkların kayma kuvvetlerine göreli kararsızlığı dikkate alınmalıdır. Santrifüj kuvveti kayma şokunun tek kaynağı değildir, daha önemlisi ekipman tasarımıdır, özellikle ithalat ve ihracatta da önemli kayma şoku vardır. Farklı ölçeklerin tasarımındaki farklılıklar, farklı ölçeklerde kaymaya duyarlı virüslerin veriminde ve geri kazanımında farklılıklara yol açabilir.

Kesmeye duyarlı virüsler, kesme geriliminin büyüklüğü ve gerilime maruz kalma süresi (devirdaim nedeniyle) yüksek olabileceğinden dikkatli bir şekilde tasarlanmalıdır. Kesmeye duyarlı virüsler için, besleme kanalındaki türbülansı ve kesme kuvvetlerini azaltmak için açık devre cihazları (içi boş fiber veya açık plaka cihazları) tercih edilir.

İşletme parametrelerinin seçimi de virüs parçacıklarına verilen zararı en aza indirecek şekilde olmalıdır: düşük çapraz akış, orta transmembran basıncı (TMP) ve kısa işlem süresi.

Yüksek basınç altında membran kontaminasyonu, muhtemelen kesme hareketinin viral zarf üzerinde etki edebileceği kuvvetler nedeniyle viral enfeksiyözlüğün kaybına yol açar. Membran bazlı ayırma boyuta dayanır ve büyük moleküler ağırlıklı viral inhibitörlerin ve viral partiküllerin birikmesi viral vektörlerin enfeksiyözlüğünü azaltabilir.

Derin filtrasyon sırasında kaymaya duyarlı virüslerin bozunumu yaygın olarak belgelenmemiştir. Derin filtrasyonda virüs kaybı çoğunlukla ürünün yakalanması, adsorpsiyonu veya zamana ve sıcaklığa bağlı viral bozunmaya atfedilir. Aslında, NFF sistemlerinde mekanik stres meydana gelebilse de, NFF ürünlerinde yaşanan hızlı tek geçiş nedeniyle NFF ürünlerinin kaymaya maruz kalma süresi diğer teknolojilere kıyasla çok kısadır.

 

2.2.2.3 Açıklık boyutuna göre kesme

100 nm'den büyük virüsler, mikoplazma veya steril sınıf membranların (0.22 μm ve altı) çıkarılmasıyla tutulabilir. Bu durumda, filtre seçimine özel dikkat gösterilmelidir. Mikrofiltrasyon TFF adımları için, iyi ürün kanalları için 0.45 μm veya 0.65 μm membranlar tercih edilir. NFF çok adımlı filtrasyon için, en yoğun katman 0.45 μm'den büyük veya eşittir. Derin bir filtre seçerken dikkatli olunmalıdır, çünkü bazı derin filtre cihazları, tutma tahrikinden ürün kaybına neden olabilecek bir film tabakası içerebilir. Virüs agregasyonu, virüs üretimini olumsuz etkiler ve virüs boyutu nedeniyle virüs tutulmasını artırır.

Andre ve Champluvier'in bir patentine göre, homojenizasyon, agrega boyutunu azaltarak filtre tıkanıklığını önleyebilir veya sınırlayabilir ve daha yüksek bir verim sağlayabilir. Homojenizasyon ayrıca hasadın filtrasyon kapasitesini de iyileştirerek 2.4-3 kat artırmıştır.

Çok fazla safsızlık virüs geri kazanımını engelleyebilir. Safsızlıklar filtreyi tıkayabilir ve tıkalı membran gözenekleri virüs geçiş oranlarının azalmasına neden olabilir. De Vocht ve Veenstra'nın bir patentinde, yüksek hücre yoğunluklu Per'in doğrudan arıtılmasının TFF ({{0}}.65 veya 0.2 μm membran) ile toplanmasının adenovirüs içermeyen virüs geri kazanımıyla sonuçlandığı belirtilmektedir. Geri kazanım, 0,65 μm TFF adımından önce konak hücre DNA'sının seçici çökeltme uzaklaştırılmasıyla elde edilebilir. Adenovirüslerin %70'i.

 

 

2.3 Vaka çalışması: Viral aşı berraklaştırmasının optimizasyonu

2011 Uluslararası Biyolojik Prosesler Konferansı'nda Sanofi Pasteur, aday viral aşılar için yeni berraklaştırılmış dizilerin geliştirilmesinde filtreleri taramak için rasyonel bir yaklaşım sundu. Araştırma, hücre ve virüs kültürü süreçlerini optimize etmede karşılaşılan sorunların üstesinden gelmeyi amaçlıyor. Yukarı akış sürecinde yapılan değişiklikler, berraklaştırma adımı sırasında %20 verim kaybına ve erken filtre kontaminasyonuna neden oldu ve ölçeklendirme yapılmadı. Sağlam ve ölçeklenebilir bir berraklaştırma adımı oluşturmak için, filtre dizisinin tamamen yeniden geliştirilmesi ve viral geri kazanım oranlarının %85'ten yüksek olması gerekiyordu.

Based on internal experience and scientific publications, the team selected 27 filters for an initial screening study. Small scale virus adsorption tests were performed on various filter media (polypropylene, nylon, cellulose ester, glass fiber, charged adsorption filter) and structures (pleated or deep filter). The virus yield was measured by ELISA and the clarifying efficiency of the preselected filtrate was compared by checking the reduction of turbidity. Preliminary screening studies showed that nylon and charged filters retained viral particles and virus recovery. Ten percent. The virus recovery rate of polypropylene and polyether sulfone filter was >. %80. Selüloz ester ve cam elyaf filtrelerin geri kazanım oranı filtrenin değerlendirilmesine bağlıdır (%20 veya %90).

İkinci adım olarak Sanofi Pasteur, tarama çalışmasında önceden seçilen yedi filtrenin çeşitli kombinasyonlarını (faz 2 veya faz 3 dizileri) değerlendirdi. Sabit akış sınıflandırma testi küçük bir filtre ile gerçekleştirildi. Ayrıca, bu deney tarama çalışmasından daha yüksek bir verim kullandı. Viral geri kazanım ve filtre kapasitesi sonuçlarına dayanarak ekip, daha fazla çalışma için en iyi iki kombinasyonu seçti.

- Sıra 1 (Aşama 2): 30 μm nominal dereceli katlanmış polipropilen ön filtre, ardından kompozit selüloz ester ve cam elyaf çok katmanlı filtre (1/0,5 μm gözeneklilik)

- Sıra 2 (aşama 3): Aynı ön filtre (30 μm nominal anma polipropilen filtre), ardından ara çok katmanlı polipropilen filtre ve son olarak asimetrik bir polieter sülfon filmi.

 

The robustness of these two clarified sequences has been challenged by repeated constant flow sizing experiments with different harvest batches. While both potential sequences demonstrated enhanced capabilities compared to the reference sequence, only sequence 1 achieved virus recovery objectives (>Şekil 1’de görüldüğü gibi %85’tir.

Şekil 1 Her filtreleme adımında ortalama virüs geri kazanımı. Üç filtrasyon dizisi için kararlılık çalışmaları değerlendirildi, bunlardan yalnızca 30 μm nominal dereceli katlanmış polipropilen ve 1.0/0.5 μm selüloz ester ve cam elyaf filtre kullanan dizi 1, genel geri kazanım hedefini karşıladı.

Santrifüjleme ayrıca birincil berraklaştırma adımı olarak değerlendirildi ve ardından {{0}}.45 μm'lik son filtrasyon gerçekleştirildi. Birkaç hız/süre çifti test edildi. 0,45 μm'lik filtrasyon hızı iki kat artırılmış olsa da, son verim %85'lik hedeften düşüktü. Sonuç olarak, santrifüjleme daha fazla incelenmedi.

Son olarak, polipropilen ve cam elyaf filtrasyon dizilerinin performansı daha büyük bir ölçekte (160 L biyoreaktör boyutu) değerlendirildi. Filtre dizisi Şekil 2'de gösterilmiştir.

Şekil 2 Filtre kombinasyonunu ve dizenin adım veriminin grafiksel bir gösterimini açıklar. Tren A geleneksel işlemdir ve tren B optimize edilmiş işlemdir. Optimize edilmiş dizi B, ön filtrasyon alanını 3 kat azaltabilir, ara filtrasyon adımını iptal edebilir ve son filtrasyon alanını 10 kat azaltabilir, böylece küresel virüs kurtarmayı %3 oranında artırabilir.

Birkaç parti, filtre tıkanıklığı belirtisi olmadan, üretim limitleriyle uyumlu işlem süresi ve %85'ten fazla virüs verimiyle başarıyla berraklaştırıldı. Berraklaştırma adımı optimizasyonunun, aşının alt akış adımları ve temel kalite özellikleri üzerinde hiçbir etkisi olmadı. Bu nedenle, seçilen berraklaştırma dizisi aşı üretim sürecinde (1000 L boyutunda biyoreaktör) kullanıldı ve performans başarıyla doğrulandı.

 

03 Bakteriyel aşıların açıklığa kavuşturulması

3.1 Bakteriyel aşıların açıklığa kavuşturulmasına ilişkin hususlar

Medical Thesaurus'a (2015) göre, bakteriyel aşı, bakteriyel hastalıkları önlemek veya tedavi etmek için bağışıklık tepkisi oluşturmak amacıyla kullanılan seyreltilmiş veya öldürülmüş bakterilerin veya antijenik türevlerinin bir süspansiyonu olarak tanımlanır. Daha genel olarak, bakteriyel aşılar aktif antijen türüne göre dört alt kategoriye ayrılabilir. Bu ajan şunlar olabilir:

- Tüm canlı bakterileri öldürür veya zayıflatır. BCG aşısı olarak da bilinir.

- Antijenik determinantların saflaştırılması (alt ünite aşıları). Şarbon aşısı veya hücresiz boğmaca aşısı.

- Bakteriyel toksinler (toksoidler). Difteri ve tetanos toksoidleri.

- Plazmit (pDNA).

Ailenin ürünlerinin geniş heterojenliği nedeniyle, yukarı ve aşağı akış süreci zorlukları büyük ölçüde üretilen aşının türüne bağlıdır. Bu nedenle, ilk fermantasyon adımından sonra saflaştırılabilir veya saflaştırılmayabilir, böylece berraklaştırma adımı gerçekleştirilebilir.

 

3.2 Bakteriyel aşı berraklaştırma stratejisi

3.2.1 Toksikoid

Aşı kullanımı için üretilen en yaygın iki toksoid, sırasıyla Corynebacterium diphtheriae ve Clostridium tetani tarafından üretilen difteri ve tetanozdur. Her iki aşının üretimi de sıkı düzenleyici gerekliliklere tabidir. WHO teknik raporu ve ekleri, tetanoz ve difteri aşılarının kalitesini, güvenliğini ve etkinliğini sağlamak için net önerilerde bulunur. Her iki aşının üretimi için de Genel İyi Üretim Uygulamaları geçerlidir ve çalışanlar uygun şekilde eğitilmeli ve her iki hastalığa karşı da güçlendirici aşılanmalıdır.

GMP, nihai ürünün saflığı ve kalitesinin gösterilmesini kesinlikle gerektirir. WHO ve EP'ye göre, nihai tetanos aşısının etkinliği, tetanos toksoidi için Uluslararası Standart'a göre uluslararası birimlerde kalibre edilmiş uygun bir referans madde ile in vivo veya kanıtlanmış başka bir yöntemle karşılaştırılarak belirlenmelidir. Etkinlik için güncellenmiş gereksinimler 2011'de yayınlanmıştır ve değerlendirme yöntemine bağlı olarak değişebilir. Her aşı partisinin güvenliği (toksinsiz ve restoratif toksisite) de gösterilmelidir. Son olarak, özellikle gerçek zamanlı olarak aşıların stabilitesi ele alınmalıdır.

 

3.2.2 Plazmit DNA aşısı

Plazmit DNA aşıları hayvan sağlığı amaçları için kullanılır ve insan kullanımı için çeşitli plazmit DNA aşıları çeşitli geliştirme ve klinik değerlendirme aşamalarındadır. E. coli fermantasyonundan sonra, bakteriler toplanır ve plazmit DNA'sını serbest bırakmak için kesilir.

Hücre artıklarının uzaklaştırılması genellikle santrifüjleme veya filtrasyonla gerçekleştirilir. Konu son yayınlarda kapsamlı bir şekilde ele alınmıştır. Bu yayında, güncel yukarı akış, aşağı akış ve formülasyon pDNA süreçleri ve zorlukları ele alınmıştır.

Yazarlar ayrıca tipik pDNA üretim sürecinin her adımındaki boşluklara ve daha fazla süreç optimizasyonuna yol açabilecek potansiyel gelecekteki yeniliklere ve/veya mevcut teknoloji boşluklarına ilişkin içgörüler sunmaktadır.

Plazmit DNA aşıları iki adımda hazırlanır. İlk olarak, bakteri hücreleri kültür ortamından çıkarılır ve ikinci olarak, hücre lizisi çıkarıldıktan sonra hücre artıkları çıkarılır. Ölçeğe bağlı olarak, hücreler santrifüjleme veya TFF mikrofiltrasyonu kullanılarak toplanır. Disk-yığın santrifüjü yüksek hızda aralıklı olarak dışarı atılır ve deşarj sırasında kayma hasarı nedeniyle süper sarmal plazmitlerin verimi düşüktür. Santrifüjleme kullanılması gerekiyorsa, katı kase santrifüjü en iyisidir. 0.1 veya 0.2 μm mikrofiltrasyon membranlı açık kanallı, düz TFF cihazları veya içi boş fiber cihazlar iyi çalışabilir.

İçi boş fiber cihazlar yüksek katı yük kapasitesine sahip olduğundan, bazen bunlara öncelik verilir. Tipik olarak bu işlemler, konsantrasyonun 3-5 katı, ardından 3-5 hacim transfiltrasyonla çalışır. Kesme kuvvetini azaltmak ve membran polarizasyonunu daha iyi kontrol etmek için, penetrasyon kontrol işlemleri şiddetle önerilir. Santrifüjler büyük ölçekli ticari işlemlerde daha uygun maliyetli olsa da, daha küçük ölçekli işlemler taşınabilirlik ve kullanım kolaylığı nedeniyle filtrasyon kullanma eğilimindedir.

İşlemeyi kolaylaştırmak için flokülantlar kullanılmıştır, ancak ürün kaybına yol açabilir. Bazıları ayrıca inert diatomlu toprak parçacıklarının kullanılmasını ve ardından torba filtrasyonunu önermektedir.

Cell lysis produces viscous products, including large particles, cell fragments, soluble impurities, fine colloidal particles, and pDNA. Due to the complexity of the material, removing such fine solids is a difficult separation. Gradient density deep filter or open hole structure (>0.45m) membran filtreler hücre artıklarını gidermede iyidir. Hücre artıklarının güçlü tıkanması nedeniyle düşük akış veya düşük basınç filtrasyonu tercih edilir. Bu adım için Tff tabanlı mikrofiltreler ve endüstriyel ölçekli torba filtreler kullanılmıştır. Statik (bir karıştırma kabında) ve sürekli (bir hat içi statik karıştırıcı kullanılarak) çatlatma farklı filtreler gerektirir.

 

3.3 Vaka çalışması: Tetanos toksinlerinin arıtılmasında santrifüjleme, NFF ve TFF yöntemlerinin etkinliğinin karşılaştırılması

Muniandi ve ark. fermantasyon sıvılarından tetanos toksinlerini ve toksoidlerini arıtmak için üç farklı yöntemi karşılaştırdılar, bunlar santrifüjleme, derin filtrasyon (NFF) ve TFF'dir. Test materyali, modifiye edilmiş bir Miller (MMM) ortamı kullanılarak 4{5}}0L'lik bir fermantasyon cihazında üretildi. Santrifüjleme çalışmasında, hücreler 60 dakika boyunca 6 × 1L'lik bir kapta 4000 RPM'de kalpten ayrıldı. Toksoid geri kazanımını tespit etmek için üstteki sıvıdan örnekler alındı. Derin filtrasyon, fermantasyon suyunu arıtmak için diatomlu toprak ve selüloz içeren 0,45μm ve 0,22μm derin filtreler kullanır. İşlem 35 derece ve 12psi'lik bir sıcaklıkta gerçekleştirilir.

TFF yönteminde açık düz panelli bir TFF modülü, 0.22μm PVDF membrana termal olarak bağlanır. TFF tabanlı berraklaştırma işlemi, 23 derecede 2000 L/saatlik bir çapraz akış hızında gerçekleştirildi ve berraklaştırılmış filtrat, geleneksel bir TFF sandviç 30kD PES membran kullanılarak 25 derecede 1000 L/saatlik bir çapraz akış hızında yoğunlaştırıldı. Berraklaştırılmış et sıvısı (yaklaşık 6L), bu ultrafiltrasyon işleminde 10 kat yoğunlaştırılır. Ürün geri kazanımını değerlendirmek için yoğunlaştırılmış tutucu numuneler üzerinde tetanos toksoid testleri gerçekleştirildi.

Derin filtrasyon yaklaşık %89'luk bir ürün geri kazanım oranıyla sonuçlanırken, TFF üniteleri %97'nin üzerinde bir ürün geri kazanım oranıyla sonuçlanmıştır. Mikrofiltrasyon ve ultrafiltrasyon prosesleri sürekli olarak NFF prosesinden daha yüksek ürün geri kazanımları sağlar. Bu sonuçlar flokülasyon testlerine (Lf) dayanmaktadır.

 

04Polisakkarit aşıların açıklanması

4.1 Polisakkarit aşı açıklamasının değerlendirilmesi

Hem ayrık/serbest polisakkarit aşılarının hem de eşleşmiş polisakkarit aşılarının üretim süreci, bir fermentörde konak bakterinin kültürüyle başlar. Fermantasyonun sonunda, bakteriler DOC (sodyum deoksikolat), Triton®X-100 veya bakterileri yok etmek ve polisakkaritlerin salınımını teşvik etmek için diğer uygun reaktifler gibi temizlik maddeleriyle işlenebilir. Büyük pil kapasitesi nedeniyle, doğrudan NFF aracılığıyla toplama ekonomik olarak uygulanabilir değildir çünkü verim çok düşük olabilir. Bu nedenle, hücre kümelerini ayırmak için bir santrifüj kullanmak ideal seçimdir. TFF mikrofiltrasyon aralığı da kullanılabilir. İlgi duyulan polisakkariti içeren hücresiz merkez/penetrant, bir NFF derin filtrasyon sistemiyle daha da berraklaştırılır, ardından biyolojik olarak parçalanmış filtrasyon yapılır ve daha sonra daha fazla saflaştırma için aşağı akış işlemine geçilir.

 

4.2 Polisakkarit aşısı berraklaştırma stratejisi

4.2.1 İlk Açıklama Prosedürü

Santrifüjleme, hücreleri fermantasyon sıvılarından ayırmak için en yaygın tekniklerden biridir. Ölçeğe bağlı olarak, sürekli santrifüjleme veya toplu santrifüjleme seçilebilir. Başarılı bir akış aşağısı saflaştırma için santrifüjleme koşullarının ve bunların çalışmasının uygun şekilde optimize edilmesinin önemli olduğunu belirtmek önemlidir. Belirli bir TFF membranı ve gözenek boyutu seçerken, genellikle büyük ve yapısal olarak karmaşık olan ve moleküler ağırlıkları yaklaşık 500kDa'dan 1000kDa'dan fazlasına kadar değişen polisakkaritlerin moleküler ağırlığını akılda tutmak önemlidir. Büyük açık gözenek boyutu nedeniyle, 0,22μm, 0,45μm, 0,65μm MF membranların kullanımı, ozmotik çözeltide PS moleküllerinin başarılı bir şekilde geri kazanılmasını sağlayabilir.

 

4.2.2 İkincil Arıtma Prosedürü

İkincil berraklaştırma adımına ulaşan hücresiz fermantasyon çözeltisinin berraklığı/bulanıklığı, belirli bakteriye, bölünme türüne, bireysel serum türüne ve birincil berraklaştırma adımı için kullanılan tekniğe bağlıdır. Merkezin bulanıklığı yaklaşık 50 ila 150 NTU arasında değişebilir. Selüloz liflerle doldurulmuş emdirilmiş diatomitten yapılmış pozitif yüklü kesirli yoğunluklu derin bir filtre, berraklaştırmak ve bulanıklığını < 5NTU'ya düşürmek için kullanılabilir.

Bu derin filtrenin hacim verimi yaklaşık 150 L/m3 ile 250 L/m3 arasında değişebilir. Tipik olarak, berraklaştırılmış ürün çözeltisi kalan hücre parçacıklarını, kolloidleri ve potansiyel mikroorganizmaları gidermek için sonraki 0,45 μm biyolojik olarak desteklenen indirgeme sınıfı veya 0,22 μm sterilize sınıf membrandan filtrelenir.

 

4.3 Vaka çalışması: Santrifüjlemeden sonra Streptococcus pneumoniae fermantasyon suyunun merkezinin berraklaştırılması

Hücreler, sürekli santrifüjleme ile %{{0}}.1 (h/h) tip 8 Streptococcus pneumoniae fermantasyon suyu (20 L) eklenerek ayrıldı. Koleksiyonun merkezi, selüloz lifleri içeren iki ayrı pozitif yüklü ve diatomlu toprak derin filtreden süzülür. Daha sonra, ayrı derin filtre filtratı, biyolojik olarak yüklenmiş indirgeme dereceli PVDF 0,45 μm membrandan süzüldü. Tüm filtrasyon testleri, peristaltik pompalarla sabit akış modunda gerçekleştirildi. Yüklü derin filtre ve Streptococcus pneumoniae serotip 8 fermantasyon suyu kullanılarak yapılan filtrasyon testleri, bulanıklığın yaklaşık 120 NTU'dan 3 NTU'ya düşmesiyle sonuçlandı. Testler, 140.150 L/m2 /saat akış hızında ve 20-25 psi uç nokta basınç farkında, yaklaşık 180-200 L/m2 hacim verimiyle gerçekleştirildi.

Benzer filtrasyon testleri Streptococcus pneumoniae serotip 19A'nın fermantasyon suyu üzerinde gerçekleştirildi. Santrifüjlenmiş 19A sıvısı, bulanıklığı yaklaşık 40 NTU'dan 3 NTU'ya düşüren yüklü bir derin filtreden geçirilerek berraklaştırılır. Testler yaklaşık 140-160 L/m2 /saat sabit akış hızında gerçekleştirildi ve yaklaşık 15 psid'lik bir uç nokta basıncında 200-230 L/m2 hacimsel verim elde edildi. Filtrasyon değerlendirme testleri sırasında toplanan ürün örneklerinin HLPC analizi, derin filtrasyon veya 0.45 μm (veya 0.22 μm) membranlar için önemli bir verim kaybı göstermedi.

 

05 Çözüm

Berraklaştırma proseslerinin geliştirilmesi, santrifüjleme, TFF-MF, derin filtrasyon ve aseptik filtrasyon gibi çeşitli birim proseslerinin entegrasyonunu gerektirir. Berraklaştırma prosesinin optimizasyonu, farklı birim operasyonlarının birbirini nasıl etkilediğinin anlaşılmasını gerektirir. Zorluk, günümüzün daha verimli biyoreaktörleri tarafından üretilen proses sıvılarının giderek karmaşıklaşan gereksinimlerini karşılamak için teknolojiler ve araçlar (ekipman ve fikstürler) seçmektir. Yukarı akış verimliliğindeki (viral titre, hücre yoğunluğu, vb.), hücre artıklarındaki ve hücre lizis ürünlerindeki artış, berraklaştırma prosesinin zorluğunu artırır ve ayırma ve filtrasyon ekipmanı seçimini karıştırır.

Ekipman tasarımı, kullanım kolaylığı ve temizlik, proses ölçeği seçimi yapılırken dikkate alınmalıdır. Bu, atılan filtrelerle uğraşırken verimli dönüşüm ve operatör güvenliğini sağlayacaktır. Berraklaştırma sürecini geliştirmek için, yukarı akış hasadının işlenmesinin maliyet açısından etkili olmasını sağlamak için berraklaştırma adımlarının güçlü bir şekilde entegre edilmesi önemlidir. Laboratuvar testlerini, pilot üretimi ve tam boyutlu işlemeyi kolaylaştırmak için çeşitli filtrasyon üniteleri kolayca temin edilebilir. Birden fazla berraklaştırma seçeneğini değerlendiren iyi tasarlanmış bir ölçeklendirme çalışma planı uygulayarak, işletme maliyetlerini azaltırken aşağı akış ünitesi operasyonlarını korumak için berraklaştırma filtrelerini güvenle seçebilir ve boyutlandırabilirsiniz.

Aşı berraklaştırması çeşitli zorluklar sunar. Tipik olarak, filtrasyon sürecinin aşılara değil, üretim sistemine, inaktivasyon veya lizis ajanına ve antijen sunumuna göre uyarlanması gerekir. Geleneksel aşı süreçleri genellikle aşıyı başlangıçta berraklaştırmak için santrifüjleme kullanır. Çoklu teknoloji platformlarına ve daha küçük işlem hacimlerine sahip modern aşılar, aşıları membran tabanlı teknolojilerle berraklaştırma için daha uygun hale getirir. Modern hücre hatları ve ifade sistemleri kullanan ve daha tanımlanmış hücre kültürü koşulları kullanan yeni geliştirilen aşılar, birçok aşı sürecini filtrasyona daha elverişli hale getirir.

 

Ancak, aşı ürünlerinin antijenik bileşenindeki veya "hedef antijenindeki" heterojenlik, filtrasyon berraklaştırmasının karmaşıklığını artırır. Antijenler boyut, yüzey kimyası ve yük açısından farklılık gösterir. Bu özellikler antijenlerin verimini ve geri kazanımını etkiler. Aşılar, esas olarak makromoleküllerinin boyutu nedeniyle berraklaştırma için benzersiz zorluklar sunar. Bu, berraklaştırma etrafındaki yetenek sorunlarıyla birleştiğinde, süreç geliştirme stratejileri konusunda rehberliğe olan ihtiyacı artırır.

Aşı üretimi için ticari ölçekli bir operasyonun boyutu ve ölçeği, berraklaştırma teknolojisinin seçimi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. İşlemin yukarı akışında yer aldığından, uygun berraklaştırma optimizasyonu, işlemin verimini, geri kazanımını ve sağlamlığını en üst düzeye çıkararak, aşağı akış birim operasyonlarının başarısı için kritik öneme sahiptir. Santrifüjleme, birincil berraklaştırma için uygulanabilir bir teknik seçenek olmaya devam ederken, birincil berraklaştırma için açık kanal mikrofiltrasyon üniteleri (TFF) ve ikincil berraklaştırma için ince derin filtreler veya membran filtreler aşı endüstrisinde kabul görmektedir. Bu değişim, daha hızlı işleme, hızlı işlem geliştirme, taşınabilir işlemler ve tek kullanımlık uygulamalara duyulan ihtiyaçtan kaynaklanmaktadır. NFF, küçükten büyüğe tek kullanımlık seçenekler için uygun ekonomik bir işlem sunar. Değişen düzenleyici ihtiyaçlar nedeniyle, otoklavlama için tasarlanmış gama ışınlamalı ön-aseptik cihazların veya modüllerin kullanılabilirliği, NFF veya TFF tabanlı teknolojilerin daha hızlı adaptasyonunu teşvik eder.

Birçok klasik aşı süreci, büyük ölçüde düzenleyici kısıtlamalar ve yeniden doğrulama ve yeniden gönderim veya klinik denemelerin ilişkili yüksek maliyetleri nedeniyle berraklaştırma ünitesi operasyonlarının evrimini içerir. Filtrasyona dayalı berraklaştırma şemasını kullanan platform süreci, birçok biyolojik ajanda yüksek bir başarı derecesiyle yaygın olarak kullanılmıştır. Bu belgede özetlenen örnekler ve vakalar, aşı üreticilerinin şablon yaklaşımını izleyerek bu düzeyde kararlılığa, ekonomik uygulanabilirliğe ve tek kullanımlık faydaya ulaşma potansiyeline sahip olduğunu göstermektedir.

Filtrasyonun santrifüjlemeye göre diğer avantajları arasında kesmeye duyarlı virüsler veya hava arayüzünde birikme eğiliminde olan virüsler bulunur. Cihaz üreticileri pazara yeni ürünler getirdikçe, aşı üreticileri berraklaştırma süreci için daha iyi donanımlı olmaya devam edecektir.

 

Yerelleştirme devresindeki ilk şirket olarak Guidling Technology, aşı berraklaştırma konusunda yeterli ilgili deneyim biriktirmiştir. Guidling Technology, biyofarmasötik ve hücre kültürü, saflaştırma ve ayırmaya odaklanan bir geliştirme ve üretim şirketidir. Ürünler biyomedikal, tanı, endüstriyel sıvı filtrasyonu, tespit, berraklaştırma, saflaştırma ve konsantrasyon işlemlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır; Guidling, biyofarmasötik ve hücre kültürünün uygulama senaryolarını tam olarak karşılayan ultrafiltrasyon santrifüj tüpü, ultrafiltrasyon/mikrofiltrasyon membran kaseti, virüs giderme filtresi, teğetsel akış filtre cihazı, derin membran yığını vb. başarıyla geliştirmiştir.

Membranlarımız ve membran filtrelerimiz, ön filtrasyon, mikrofiltrasyon, ultrafiltrasyon ve nanofiltrasyonun konsantrasyonu, ekstraksiyonu ve ayrılmasında yaygın olarak kullanılır. Küçük tek kullanımlık laboratuvar filtrasyonundan üretim tipi filtrasyon sistemlerine, sterilite testine, fermantasyona, hücre kültürüne ve daha fazlasına kadar geniş ürün yelpazemiz, test ve üretim ihtiyaçlarını karşılayabilir.