Yüksek kaliteli rekombinant protein saflaştırması için bir kılavuz: akış aşağı süreç optimizasyonu ve teğetsel akış filtreleme uygulamaları

Rekombinant proteinler biyofarmasötikler, aşı gelişimi ve in vitro teşhislerde yaygın olarak kullanılır. Saflaştırma kaliteleri, nihai ürünün aktivitesini, istikrarını ve güvenliğini doğrudan etkiler. Akış aşağı saflaştırma, yüksek saflıkta, yüksek verimli proteinler elde etmek için kritik adımdır. Teğetsel akış filtrasyonu (TFF), verimliliği ve ölçeklenebilirliği nedeniyle, protein saflaştırma iş akışlarında giderek daha fazla hayati bir araç haline geliyor.

Bu makale, TFF teknolojisinin uygulama stratejilerine odaklanarak rekombinant proteinlerin aşağı akış saflaştırılmasındaki temel adımları sistematik olarak özetlemektedir. Araştırma ve endüstriyel kullanıcılara saflaştırma süreçlerini optimize etmede ve protein kalitesini arttırmada yardımcı olmayı amaçlamaktadır.

 

I. Rekombinant proteinlerin akış aşağı saflaştırılmasında çekirdek adımlar

1. hücre hasadı ve liziz

Santrifüj\/derinlik filtrasyonu: hücre enkazlarını ve safsızlıkları giderir; Bakteriyel, maya vb. İfade sistemleri için uygundur.

Sonikasyon\/yüksek basınçlı homojenizasyon: Hedef proteinleri serbest bırakmak için hücreleri kırar; Koşullar protein denatürasyonunu önlemek için optimizasyon gerektirir.

Enzimatik liziz: Örneğin bakteriler için lizozim tedavisi; nazik koşullar ama daha yüksek maliyet.

2. Primer Saflaştırma: Hedef proteinin yakalanması

Afinite kromatografisi (örn. His-etiketi, protein A\/G): yüksek özgüllük bağlanması; tek bir adımda yüksek saflık elde eder.

İyon değişim kromatografisi (IEX): proteinleri yük farklılıklarına göre ayırır; Erken-orta aşama saflaştırması için uygundur.

Hidrofobik etkileşim kromatografisi (HIC): Protein yüzeyi hidrofobikliğinde farklılıklar kullanır; Belirli bir şekilde saflaştırılması zor proteinler için etkilidir.

3. Parlatma: Saflığı Artırma

Boyut-dışlama kromatografisi (SEC): agregaları ve küçük molekül safsızlıklarını giderir; sınırlı yükleme kapasitesi.

Multimodal kromatografi (örn. Capto yapışması): Daha yüksek çözünürlük için çoklu etkileşim modlarını birleştirir.

4. Konsantrasyon ve tampon değişimi

Ultrafiltrasyon santrifüj cihazları: küçük ölçekli örnekler için uygun; protein kaybına eğilimli.

Teğetsel akış filtrasyonu (TFF): Verimli, ölçeklenebilir, endüstriyel üretim için ideal (daha sonra detaylandırılır).

5. Sterilizasyon ve Depolama

0. 22 um Filtrasyon: Steriliteyi sağlayan mikroorganizmaları giderir.

Stabilizatörlerin (örn., Gliserol, BSA) eklenmesi: Protein bozulmasını önler.

 

İi. Teğetsel akış filtrasyonunun (TFF) aşağı akış saflaştırmasında temel uygulamaları

Teğetsel akış filtrasyonu (TFF), teğetsel akış yoluyla membran kirlenmesini azaltır, bu da büyük hacimli numuneleri değiştirmeye, tuzdan arındırma ve tampon için uygun hale getirir. Çıkmaz filtrasyona göre önemli avantajlar sunar (örn. Ultrafiltrasyon santrifüjleme).

 

1. TFF teknolojisinin avantajları

✔ Yüksek iyileşme: Protein adsorpsiyon kayıplarını en aza indirir, özellikle değerli örnekler için çok önemlidir.

✔ Doğrusal ölçeklenebilirlik: laboratuvar ölçeğinden (10 mL) üretim ölçeğine (1000L+) uygulanabilir.

✔ İşlem esnekliği: Tek bir sistem konsantrasyon, diyaliz (tampon değişimi) ve diyafiltrasyon gerçekleştirebilir.

 

2. TFF kaset\/membran seçim kılavuzu

Membran malzemesi	Özellikler	Uygulama senaryoları
Poliethersulfone (PES)	Düşük protein bağlanması, kimyasal olarak kararlı (pH'a dayanıklı), yüksek akı	Sert arabellek koşulları
Rejenere Selüloz (RC)	Düşük protein bağlanması, yüksek akı, rutin protein	Rutin protein\/antikor saflaştırması

Moleküler Ağırlık Kesme (MWCO) Seçim Yönergeleri:

Hedef proteinin moleküler ağırlığının 1\/3 ila 1\/5'si (örneğin, 30 kDa proteini için 10 kDa membran kullanın).

Agregaları çıkarmak için, daha küçük bir gözenek boyutu seçin (örneğin, 100 kDa proteini için 50 kDa membran kullanın).

 

3. Kritik TFF çalışma parametrelerinin optimizasyonu

Transmembran basıncı (TMP): tipik olarak 3-15 psi; Aşırı yüksek TMP kirlenmeyi teşvik eder.

Teğetsel akış hızı: Konsantrasyon polarizasyonunu en aza indirmek için türbülansı korur; Tipik olarak 4-8 ​​l\/dk · m².

Verim İyileştirme Teknikleri:

Tam değişim için diafiltrasyon sırasında 2-5 tampon hacmi kullanın.

Kalıntı proteini geri kazanmak için sonunda geri uçurma yapın.

 

4. Tipik Olgu Çalışması: Monoklonal Antikor (MAB) Saflaştırma

AÇIKLI Hücre Kültürü Sıvısı → Protein A afinite kromatografisi → Düşük PH viral inaktivasyonu → TFF konsantrasyonu + tampon değişim → Parlatma (Sec\/IEX) → Steril filtrasyon

 

TFF Rolü:

Seyreltili protein A Ellenatını hedef konsantrasyona hızla konsantre eder.

Tamponu PBS veya formülasyon tamponuna (örn. Histidin tamponu) değiştirir.

 

III. Yaygın sorunlar ve çözümler

❌ Sorun 1: Düşük protein geri kazanımı

Olası nedenler: membran adsorpsiyonu; Aşırı konsantrasyon nedeniyle yağış.

Çözümler: düşük bağlayıcı membrana geç; Yüzey aktif madde ekleyin (örneğin, 0.% 01 Tween 20).

❌ Sorun 2: Hızlı akı düşüşü

Olası nedenler: Membran kirletme veya konsantrasyon polarizasyonu.

Çözümler: teğet akış hızını optimize edin; Düzenli geri dönme uygulayın; Daha açık bir membran yapısına geçin (örn. 10 kDa yerine 30 kDa).

❌ Sorun 3: Protein Toplama

Olası nedenler: aşırı kesme kuvveti; uygun olmayan tampon.

Çözümler: Pompa hızını azaltın; Daha yumuşak tamponlar kullanın (örn., Sükroz veya NaCl içeren).

 

IV. Özet

Yüksek kaliteli rekombinant proteinler elde etmek, akış aşağı saflaştırma süreçlerini optimize etmeye dayanır. Teğetsel akış filtrasyonu (TFF) teknolojisi, verimliliği ve ölçeklenebilirliği ile konsantrasyon ve tampon değişimi için kritik bir araç haline gelmiştir. Membran kasetlerini rasyonel olarak seçerek, operasyonel parametreleri optimize ederek ve kromatografi tekniklerini entegre ederek, hem protein saflığı hem de verim, hem araştırma hem de endüstriyel ölçekli üretimin taleplerini karşılayarak önemli ölçüde artırılabilir.